Analyse des durch den Isolationsfaktor CTCF vermittelten Einfluss auf Chromatin

Abstract

Die Regulation der Genaktivität ist wichtig für die Differenzierung und Entwicklung von Zellen höherer Organismen. Nur eine zellspezifische Genexpression kann zu der Ausbildung von unterschiedlichen Geweben und Organen und somit zu der Ausprägung eines vielzelligen Organismus führen. Die Expression von Genen in eukaryotischen Zellen ist deshalb genauestens reguliert. Isolatorelemente unterteilen das Genom in funktionelle Bereiche, indem sie einerseits Gene von ungewollter Enhancer-Aktivität abschirmen und andererseits die Ausbreitung von Heterochromatin in transkriptionell aktive Bereiche verhindern. Das Protein CTCF spielt eine wichtige Rolle in der Genregulation und ist in Vertebraten der einzig bekannte Faktor, der die Enhancerblockade-Aktivität von Isolator-Elementen ausübt. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht bekannt. Ob CTCF ebenfalls generell an der Barriere-Aktivität von Isolatorelementen beteiligt ist, wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Funktion von CTCF in der Isolation genauer zu beleuchten. Nach Identifizierung potentieller CTCF-Barriereelemente in HeLa-Zellen sollten diese auf ihre Funktionalität hin überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass CTCF in HeLa-Zellen an mindestens zwei Genloci einen heterochromatischen von einem euchromatischen Bereich mit aktiven Genen trennt und dass die Herunterregulierung der CTCF-Expression mit einer Herunterregulierung der Transkription der untersuchten Gene einhergeht. Zusätzlich wurde mittels eines Modellsystems der direkte Einfluss von CTCF auf Chromatin untersucht. So konnte demonstriert werden, dass CTCF die Dekondensierung eines heterochromatischen DNA-Arrays vermittelt, was mit Euchromatinisierung und Rekrutierung des Faktors WDR5 assoziiert ist. WDR5 scheint ein Brückenfaktor für mehrere Enzymkomplexe zu sein, die die Einführung von euchromatischen Histonmodifikationen katalysieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass CTCF tatsächlich in der Lage ist, die Umwandlung von fakultativem Heterochromatin in Euchromatin zu dirigieren, was einem generellen Kennzeichen der Barriereaktivität entspricht. Regulation of gene expression is very important for proper differentiation and development of higher organisms. At the same time a cell-specific gene expression is crucial for specification of different tissues and organs and thereby for the formation of a multicellular organism. Thus, gene expression in eukaryotic cells is tightly regulated. Insulator elements divide the genome into functional domains by shielding genes from inappropriate enhancer action or by blocking the spread of heterochromatin into transcriptionally active domains. The factor CTCF plays an important role in regulating gene expression. Furthermore, in vertebrates it is the only factor known to execute enhancer blocking activity of insulator elements. However, the mechanism behind this function is still unknown. Moreover, a general participation of CTCF in the barrier activity of insulator elements is controversely discussed. Therefore, this thesis was aimed at elucidating the function of CTCF in insulation. Following identification of potential CTCF barrier elements, these were analyzed regarding their functionality. CTCF binds at the boundary of at least two gene loci in HeLa cells and downregulation of its expression is associated with downregulation of the analyzed genes. Additionally, a model system was used to determine the direct influence of CTCF on chromatin. Utilizing this, it was shown that CTCF is mediating the decondensation of a heterochromatic DNA array. This decondensation is accompanied with establishment of euchromatin and recruitment of the factor WDR5. This protein has been reported to interact with different enzymatic protein complexes involved in the introduction of euchromatic histone modifications. The results of this thesis suggest that CTCF is indeed capable of directing the conversion from facultative heterochromatin to euchromatin, corresponding with a general feature of barrier activity.