Regulation von NADPH-Oxidasen und NO-Synthasen in einem Zigarettenrauch-induzierten COPD-Mausmodell

Abstract

COPD ist die häufigste chronische Erkrankung des Respirationstraktes und Hauptursache für hohe Morbidität und Mortalität weltweit, sowie mittlerweile sozioökonomisch von großer Bedeutung. Bisher ist die Erkrankung nicht heilbar, lediglich Symptom-lindernde Therapieformen sind verfügbar. Um neue Therapieansätze zu identifizieren, müssen die molekularen Mechanismen der Pathogenese der COPD tiefgründiger erforscht und aufgedeckt werden. Es existieren zunehmend Beweise dafür, dass oxidativer Stress ein wichtiges Merkmal bei COPD darstellt. Es gibt Hinweise darauf, dass NADPH-Oxidasen und NO-Synthasen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Persistierung kardio-vaskulärer Erkrankungen spielen könnten. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, aufzuzeigen, ob NADPH-Oxidasen und NO-Synthasen in vivo bei der Entwicklung von COPD eine entscheidende Rolle spielen könnten und per se Regulationen durch Zigarettenrauch-Applikation unterworfen sind. Diese Arbeit konnte zum ersten Mal die Regulation aller NADPH-Oxidasen durch Selektion von Zeitpunkten akuter, subchronischer und chronischer Rauchapplikation aufzeigen, von der Initiierung bis hin zur Ausprägung der Erkrankung. Mit Hilfe des verwendeten Zigarettenrauch-induzierten COPD-Mausmodells konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Untereinheiten zu unterschiedlichen Zeitpunkten diversen Regulationen in verschiedenen Kompartimenten der Lunge unterlagen. Auf Seite der NADPH-Oxidasen schienen der Aktivator NOXA1 und Organisator NOXO1 und bezüglich der NO-Synthasen iNOS eine außerordentliche Stellung in der Pathogenese einzunehmen. NOXA1 war besonders in relativ frühen Zeitpunkten der COPD-Entwicklung akuter (2 Wochen) und subchronischer (3 Monate) Rauchapplikation verstärkt in Gesamtlunge und pulmonalen Gefäßen exprimiert worden. NOXO1 hingegen zeigte eine permanente Hochregulation in allen untersuchten Kompartimenten. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die induzierbare NO-Synthase zwar nicht in Lungenhomogenat von WT-Mäusen, jedoch speziell in pulmonalen Gefäßen erhöhte Expressionen aufwies, einhergehend mit Senkung der eNOS-Expression. NOXA1, NOXO1 und iNOS waren darüber hinaus in der Lunge, besonders in pulmonalen Gefäßen co-lokalisiert und in gp91phox-/--Mäusen, die Emphysem mit und ohne Rauchexposition bildeten, deutlich überexprimiert. Diese Überexpressionen gingen einher mit verstärkter Bildung von Nitrotyrosin, das aus Superoxid (vor allem NOX-generiert) und NO (iNOS-generiert) gebildet wird, so dass auf eine Synergie dieser Proteine geschlossen werden kann. Diese Beobachtungen konnten in Lungen von humanen COPD-Patienten bestätigt werden. Weiterhin führte Rauchexposition bzw. die Deletion von gp91phox zur Aktivierung von MAP-Kinasen, wodurch vermehrt Proliferation und wahrscheinlich auch Apoptose vermittelt wurde. Die Proliferation konnte durch erhöhte Expression von Cyclin D1 und PCNA nachgewiesen werden. Alveoläre und vaskuläre Charakterisierung und Lungenfunktionstests von 8 Monate Rauch-exponierten Wildtyp- und gp91phox-/--Mäusen zeigte, dass Rauchexposition im Wildtyp und in den Knockouts zu Emphysembildung, verstärkter Muskularisierung und gleichzeitigem Verlust pulmonaler Gefäße, pulmonaler Hypertonie, Rechtsherzhypertrophie und Einschränkung der Lungenfunktion führte. Die Kontrolltiere der Knockouts zeigten vergleichbare Veränderungen mit Ausbleiben der Rechtsherzhypertrophie. Dagegen entwickelten sie spontanes Emphysem ohne die Notwendigkeit der Induktion durch Zigarettenrauch. Da Untersuchungen von MMP-12 ergaben, dass dieses sowohl nach Rauchexposition und in verstärktem Maße nach Ablation von gp91phox exprimiert wurde, könnte u.a. MMP-12 für die Emphysementwicklung bei den Rauch-exponierten Tieren und vor allem bei den nicht-exponierten Knockout-Individuen verantwortlich sein. Durch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse, gestützt durch parallele Untersuchungen und diverser Veröffentlichungen kann geschlossen werden, dass NADPH-Oxidasen, besonders NOXA1 und NOXO1, wahrscheinlich in Verbindung mit NOX1, und iNOS eine bedeutende Rolle für die progressive Pathogenese der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung spielen, wodurch sie potentielle Targets für die Entwicklung neuer Therapieformen darstellen. COPD is the most frequent disease of the respiratory tract and a major cause of high morbidity and mortality worldwide. Furthermore, it is of high socioeconomic importance. So far, the disease is not curable, only symptom-alleviative therapies are available. To identify new therapeutical approaches it is necessary to investigate the molecular mechanisms of the pathogenesis of COPD in detail. There is increasing evidence that oxidative stress displays an important characteristic of COPD. There are hints that NADPH oxidases and NO synthases could play an important role for the development and persistence of cardio-pulmonary diseases. The aim of the present study was to show whether NADPH oxidases and NO synthases are critical for the development of COPD in vivo and if they are regulated by smoke exposure per se. This study shows for the first time the regulation of all NADPH oxidase subunits during time points of acute, subchronic and chronic smoke application, from the initiation up to the occurrence of the disease.By usage of a tobacco smoke induced COPD mouse model, it could be shown that the different subunits are regulated at different time points in different compartments of the lung. NOXA1 and NOXO1, as NADPH oxidase subunits, and iNOS, as a NO synthase, seemed to have an extraordinary status for the pathogenesis. NOXA1 was specially upregulated in lung homogenate and pulmonary vessels in relative early time points of acute (2 weeks) and subchronic (3 months) smoke exposure during the development of COPD. In contrast, NOXO1 showed a constitutive upregulation in all investigated compartments. Moreover, it could be shown that the inducible NOS did not show increased expression in lung homogenate indeed, however specially in pulmonary vessels accompanied by a decrease of the eNOS expression. Furthermore, NOXA1, NOXO1 and iNOS were co-localized in the lung, especially in pulmonary vessels. They were clearly upregulated in gp91phox-/--mice which developed emphysema with and without smoke exposure. These overexpressions were associated with increased formation of nitrotyrosine which is formed by superoxide (primarily NOX-generated) and NO (iNOS-generated), so that one can conclude a synergy or crosstalk of these proteins. Those observations could be confirmed by lungs from human COPD patients. Additionally, smoke exposure or rather deletion of gp91phox led to activation of MAP kinases mediating more proliferation and probably apoptosis, too. Enhanced proliferation could be demonstrated by increased expression of Cyclin D1 and PCNA. Alveolar and vascular characterization and lung function tests of 8 months smoke-exposed wildtype- and gp91phox-/--mice showed that smoke exposure led to emphysema development, increased muscularization and simultaneous loss of pulmonary vessels, pulmonary hypertension, right heart hypertrophy and limitation of lung function. Knockout mice without smoke exposure showed comparable changes with absence of right heart hypertrophy. In contrast, they developed spontaneous emphysema without necessity of induction by cigarette smoke. Since investigations of MMP-12 revealed an increased expression after smoke exposure and even more after deletion of gp91phox, MMP-12 could be play a potential role in emphysema development in smoke-exposed mice and first of all in non-exposed knockout mice. Taken together, the results of the present work supported by parallel investigations and diverse publications, suggest that NADPH oxidases, especially NOXA1 and NOXO1, probably in connection to NOX1, and iNOS play an important role in the progressive pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease whereby they constitute potential targets for the development of new therapies.