Untersuchungen zu den immunrelevanten Hämolymphproteinen Hämolin und Scolexin des Amerikanischen Tabakschwärmers Manduca sexta (L.)

Abstract

In dieser Arbeit wurde die Expression und der Einfluss der Proteine Hämolin und Scolexin auf ausgewählte Vorgänge des Immungeschehens in der Hämolymphe des Tabakschwärmers Manduca sexta untersucht. Zu diesem Zweck wurden immunhistochemische, proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden eingesetzt. Die Expression von Hämolin in den Hämozyten infizierter M. sexta-Larven wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Im Anschluss wurde RNA-Interferenz durch die Behandlung der Tiere mit spezifischer, doppelsträngiger RNA induziert und somitdie Expression des Hämolin unterbunden. Die darauffolgenden Infektionsversuchemit E. coli zeigten eine nahezu vollständig ausgeschaltete Nodulationsfähigkeit derKnockdown-Tiere.Der Fokus der Untersuchungen an Scolexin lag auf dessen Einfluss auf die Hämozyten während einer Immunantwort. Scolexin wurde aus einem Hämolymphpool infizierter Tiere aufgereinigt und isoliert, welches anschließend für die Generierung eines polyklonalen Antikörpers gegen Scolexin eingesetzt wurde.Unter Verwendung des Antikörpers konnte an Hämozyten-Monolayern von infizierten Larven Scolexin in allen Hämozytentypen nachgewiesen werden. Auch in Gewebeschnitten konnten auf diese Weise Hämozyten sichtbar gemacht werden. Entgegen der Erwartung aus dem bisherigen Kenntnisstand konnte man jedoch keine Markierung von Epidermis und Mitteldarmepithel, welche als Hauptsyntheseorte des Scolexin postuliert sind, nachweisen. Darüber hinaus markierte der Antikörper auch Coagulationsfäden und Hämozyten von Frischzellpräparaten. Die Expression der beiden Isoformen A und B von Scolexin wurde per RT-PCR in Hämozyten von Larven nach Infektion mit E. coli, B. megaterium und S. cerevisiae untersucht, wobei ausschließlich die Expression der Isoform A nachgewiesen werden konnte. Mittels in situ-Hybridisierung unter Einsatz spezifischer Sonden konnte zusätzlich gezeigt werden, dass alle Hämozyten-Typen Scolexin A exprimieren. Der Nachweis gelang ebenso in Embryonen von M. sexta ab dem Entwicklungsalter von 72 Stunden, d.h. nach dem Dorsalschluss. Mutmaßlich in Puppen, jedoch sicher in Imagines, konnte keine Expression nachgewiesen werden. Desweiteren wurde die Expression von Scolexin A, wie bei den Untersuchungen zu Hämolin, durch RNAi unterdrückt. Die Spezifität des Knockdowns wurde bestätigt, indem die Expression anderer immunrelevanter Proteine Lysozym und Cecropin in denselben Tieren nachgewiesen werden konnte. Es wurde auch ein anderer Ansatz zum Knockdown der Expression getestet, nämlich durch das Verfüttern von dsRNA an die Versuchstiere. Dieser Ansatz war nicht erfolgreich. Abschließend wurde der Einfluss des Knockdowns der Expression auf die Nodulationsfähigkeit und die Clearence von Bakterien untersucht. Dabei wurde kein signifikanter Effekt auf beide Vorgänge nach einer Infektion von Larven beobachtet. Der Ansatz zur Untersuchung der Phagozytosefähigkeit der Hämozyten in Knockdown-Tieren konnte nicht durchgeführt werden, da die Verwendung von FITC-markierten E. coli überraschenderweise erst gar keine Expression des Scolexin A verursacht hatte. Abschließend wurde mittels 5-RACE das 5-Ende der bekannten Scolexin-A-Sequenz bestimmt. Das Ergebnis der 5-RACE und das Fehlen der Scolexin-B-Expression in den Hämozyten ist Basis für die Hypothese, dass es sich bei den Scolexin-Isoformen eher um allelische Variationen handelt.