Generating meganucleases with new specificities by directed evolution and rational engineering approaches

Abstract

In the post-genomic era, highly specific nucleases became important tools for directed gene targeting and gene therapy. They are used to specifically cleave genomic sequences, involved in for instance diseases and by creating this double-strand break, homologous recombination, an otherwise rarely occurring event in the cell, will be stimulated. Most commonly used are zinc-finger nucleases, consisting of specific zinc-finger modules responsible for recognizing DNA, fused to the catalytic domain of the restriction enzyme FokI. Some of these zinc-finger nucleases are already in clinical trial phases. As alternative in the past three years so-called TALE-nuclease came into the focus of research. Their advantage might be the high predictability of specificity and their possibly lower cytotoxic effects due to off-site target-cleavage, which have to be confirmed in the future.In this work, two other approaches for generating highly specific nucleases were presented. The first one is based on directed evolution, where the specificity of a naturally occurring meganuclease was to be changed. The investigated enzyme belonging to the LAGLIDADG family of homing endonucleases was PI-SceI. Mutant libraries of this enzyme were assayed in a two-plasmid selection system, selecting for variants cleaving a target site differing from the natural PI-SceI target in up to seven bp. Since structural and biochemical data for PI-SceI are available, only residues known to be involved in DNA-binding were used for mutagenesis. The obtained variants, showing in vivo an up to 100 - fold increase in specificity did not show the same result in vitro, under all conditions tested. This showed that results obtained in vivo and in vitro do not necessarily correspond to each other and that the developed selection assay needs further optimization.As second approach, a more rational strategy similar to zinc-finger or TALE nucleases was pursued, by fusion of a catalytically inactive variant of the LAGLIDADG homing endonuclease I-SceI to the type IIP restriction enzyme PvuII. With this, an alternative to the often used catalytic domain of FokI as cleavage module was presented. After optimizing the linker between the two proteins and several mutations in I-SceI to abolish any catalytic activity (D44N, D145A) and mutations in PvuII to either decrease its activity (T46G, H83A or Y94F) or disturb the dimerization interface (L12E, P14G or H15D) a final variant, namely P(P14G)-L(6)-Ss*, was obtained. This enzyme showed in vitro an over 1000 - fold preference for the addressed (PvuII site flanked by two I-SceI sites) over an unaddressed site (PvuII site alone). Furthermore, this protein had an up to 10 - fold preference for the distance of 6 bp between the respective I-SceI and PvuII sites and showed no cleavage of genomic DNA (bacteriophage & #955;-DNA). The next step would be in vivo testing of this enzyme variant, ideally in planta, since there are already I-SceI target sites in several crop species available that could serve as landing platforms for gene targeting. In der post-genomischen Ära haben sich hoch spezifische Nukleasen als wichtige Werkzeuge für die Gentherapie entwickelt. Sie sollen genutzt werden, um genomische DNS-Sequenzen, die zum Beispiel in monogenetisch vererbbaren Krankheiten involviert sind, spezifisch zu spalten. Der erzeugte Doppelstrangbruch stimuliert den zelleigenen Reparatur-mechanismus der homologen Rekombination, ein Ereignis, das ansonsten selten in der Zelle vorkommt. Die momentan am Häufigsten genutzten hochspezifischen Nukleasen sind sogenannte Zink-Finger Nukleasen. Diese bestehen aus Zink-Finger Modulen, die ver-antwortlich für die spezifische DNS-Bindung sind, fusioniert an die katalytische Domäne des Restriktions-Enzyms FokI. Einige dieser Zink-Finger Nukleasen befinden sich schon in klinischen Versuchs-Phasen. In den letzten drei Jahren sind, als Alternative zu den Zink-Finger Nukleasen, sogenannte TALE-Nukleasen in den Fokus der Forschung gerückt. Ihr Vorteil ist die Programmierbarkeit ihrer Spezifität und die damit verbundene wahrscheinlich geringere Zytotoxizität. All das wird sich allerdings in der Zukunft noch bestätigen müssen.In der hier vorgestellten Arbeit werden zwei andere Ansätze zur Generierung hoch spezifischer Nukleasen präsentiert. Der erste basiert auf gerichteter Evolution, wobei die Spezifität einer natürlich vorkommenden Meganuklease geändert werden soll. Das dabei untersuchte Enzym, PI-SceI, gehört der Familie der LAGLIDADG-Homingendonukleasen an. Bibliotheken von Enzym-Varianten wurden in einem zuvor entwickelten Zwei-Plasmid System gegen Erkennungssequenzen, die sich von der natürlichen PI-SceI Erkennungs-sequenz in bis zu sieben Basenpaaren unterscheiden, selektioniert. Aufgrund bekannter struktureller und biochemischer Daten bezüglich PI-SceI, wurden nur Aminosäuren der Mutagenese unterworfen, welche in der DNS-Bindung involviert sind. Die in dieser Arbeit selektionierten Varianten von PI-SceI zeigten in vivo eine bis zu 100 - fach gesteigerte Spezifität gegenüber der neuen Erkennungssequenz, ein Ergebnis, dass in vitro unter keiner der getesteten Bedingungen bestätigt werden konnte. Dies ließ darauf schließen, dass in vivo und in vitro beobachtete Ergebnisse nicht notwendigerweise übereinstimmen und dass der hier entwickelte Assay weiter optimiert werden muss.Der zweite Ansatz verfolgt eine rationalere Strategie, ähnlich derer von Zink-Finger und TALE-Nukleasen. Hierbei wurde eine katalytisch inaktive Variante der LAGLIDADG Homingendonuklease I-SceI an das spezifische Typ IIP Restriktionsenzym PvuII fusioniert. Letzteres soll eine Alternative zur ansonsten so häufig genutzten katalytischen Domäne von FokI darstellen. Das entstandene Fusions-Enzym wurde weiterhin in der Linker-Region, welche I-SceI und PvuII miteinander verbindet, optimiert. Außerdem wurden Mutationen in I SceI eingeführt, um sämtliche katalytische Aktivität zu unterbinden (D44N und D145A). Auch PvuII wurde optimiert, indem entweder durch Aminosäure-Substitutionen die katalytische Aktivität reduziert wurde (T46G, H83A oder Y94F) oder indem das Dimerisierungspotential verringert wurde (L12E, P14G oder H15D). Das Resultat all dieser Optimierungen stellt die finale Variante P(P14G)-L(6)-Ss* dar. Dieses Enzym zeigt in vitro eine über 1000 - fache Präferenz für eine adressierte Erkennungssequenz (PvuII Erkennungs-sequenz flankiert von zwei I-SceI Erkennungssequenzen) gegenüber einer unadressierten Sequenz (PvuII Erkennungssequenz allein). Außerdem hat es eine bis zu 10 - fache Präferenz für einen Abstand von sechs Basenpaaren zwischen den I-SceI und PvuII Erkennungssequenzen und zeigt keinerlei Spaltung von genomischer DNS (Bakteriophagen & #955; DNS). Als nächsten Schritt sollte P(P14G)-L(6)-Ss* in vivo getestet werden. Dies könnte idealerweise in Pflanzen stattfinden, da es mittlerweile in einer Auswahl von bestimmten Kulturpflanzen I-SceI Erkennungssequenzen als Insertionsstellen für genetische Modifikationen gibt.