Die Regulation von Wachstumsfaktoren durch FaktorVII-aktivierende Protease

Abstract

Die Faktor VII-aktivierende Protease (FSAP) ist eine zirkulierende Serinprotease hepatischen Ursprungs. Der mit 5% Vorkommnis auftretende Einzelnukleotidpolymorphismus (G534E) Marburg I der FSAP geht mit einer deutlich reduzierten Enzymaktivität einher, und korreliert mit diversen vaskulären Erkrankungen wie Arteriosklerose, vaskulärer Kalzifizierung und Fibrose. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnten aufweisen, dass FSAP das Cystein-Knoten Protein platelet derived growth factor PDGF-BB degradiert, was eine Reduktion des fibrotischen Verhaltens von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) im Mausmodell nach sich zog. Da FSAP Proteinaktivität im Zusammenhang mit fibroproliferativen und degenerativen Erkrankungen assoziiert ist, war es fraglich, ob FSAP weitere Mitglieder der strukturell verwandten transforming growth factor-& #946; (TGF-& #946;) Superfamile der Cystein-Knoten Proteine reguliert. Dafür sollten deren reife Wachstumsfaktoren sowie ihre latenten Proformen untersucht werden.In dieser Arbeit wurden Mitglieder der bone morphogenetic protein (BMP) und der growth and differentiation factor (GDF) Familie als neue Substrate der FSAP identifiziert, die im Zusammenhang mit osteogener Zelldifferenzierung stehen und anti-proliferativ wirken. In diversen in vitro Zellsystemen wurde der Einfluss der FSAP auf die biologische Aktivität von BMP-2, pro-BMP-2, pro-GDF-5 sowie TGF-& #946; untersucht. FSAP spaltete und verstärkte die biologische Aktivität von reifen BMP-2 konzentrations- und zeitabhängig. Amino-terminale Peptid-Sequenzierung identifizierte eine Spaltung innerhalb basischer Aminosäuren und die Generierung eines um 7 Aminosäuren verkürztes Peptids (R298-K290). Ebenso wurden die latenten Proformen pro-BMP-2 und pro-GDF-5 prozessiert. Pro-BMP-2 wurde durch FSAP innerhalb der Furinspaltstelle RXXR in die reife Form überführt (R282-Q283) und zusätzlich an der gleichen Stelle wie reifes BMP-2 (R289-K290) verkürzt. Um die Spezifität der FSAP auf die Wachstumsfaktor Aktivierung zu überprüfen, wurde eine Vergleichsstudie mit diversen Proteasen durchgeführt. Lediglich strukturell verwandtes Plasmin stellte sich als BMP Aktivator heraus. Überraschenderweise erwies sich TGF-& #946;-1 nicht als FSAP Substrat. Die biologische Aktivität der prozessierten Wachstumsfaktoren wurde durch die Induktion der alkalischen Phosphatase Aktivität, Smad1/5/8-Phosphorylierung und der anti-proliferative Effekt in C2C12 Myoblasten untersucht. Die FSAP-induzierte gesteigerte biologische Aktivität der BMPs war durch den BMP-Inhibitor Noggin reversibel. Die FSAP Behandlung von BMP-2 und pro-BMP-2 führte außerdem zu ihrer verstärkten Internalisierung. Neben Myoblasten reagierten auch VSMCs auf FSAP behandeltes BMP-2 und pro-BMP-2 durch Smad1/5/8 Phosphorylierung sowie Induktion der BMP-VSMC Zielgene Id1 und Smad6. Um die Rolle von endogener FSAP zu ermitteln, wurden Hepatozyten mit FSAP siRNA transfiziert um FSAP herunter zu regulieren, und die BMP-Prozessierung mittels Aktivierung untersucht. Eine Minderung des endogenen FSAP Gehalts führte zu einer Reduktion der BMP-Spaltung und Aktivität, was sich durch Induktion des hepatischen Zielgens Hepcidin nachweisen lies. Um die beteiligten Aminosäuren der Wachstumsfaktorspaltung durch FSAP zu ermitteln, wurde eine Mutationsstudie mit pro-BMP-2 durchgeführt. Dafür wurden 5 verschiedene Konstrukte mit je einem Aminosäurenaustausch (Arg& #61664;Serin) kloniert (K278S, R282S, K285S, R282S, K290S) und in HEK293 Zellen exprimiert. Sowohl die reifen Peptide als auch zu geringerem Anteil ihre latenten Proformen wurden sekretiert. Die Mutationen hatten jedoch keinen Einfluss auf die FSAP induzierte Spaltung. Eine Triple-Mutationsstudie mit den pro-BMP-2 Mutanten SSS282 und der Mutation SSS289 in der reifen BMP-2 Kette ergab, dass nur die SSS289 Variante vor der FSAP Proteolyse geschützt war. Die Mutation der Prodomäne führte zu einer deutlich reduzierten Sekretion.In dieser Arbeit wurde ein neuer positiver Aktivierungsmechanismus von BMP-2 sowie seiner Proform durch FSAP und Plasmin identifiziert. Daher ist FSAP ein neuer Aktivator von Differenzierungs- und pro-osteogenen Faktoren. Zusammen mit dem Befund, dass FSAP den pro-proliferativen Wachstumsfaktor PDGF-BB inhibiert, vermag FSAP die Proliferation und Differenzierung von vaskulären Zellen zu kontrollieren, und den Phänotyp zur Kalzifizierung voranzutreiben. Diese reziproken Mechanismen könnten die Rolle der FSAP als Risikofaktor in fibroproliferativen und degenerativen Gefäßkrankheiten wie Arteriosklerose und vaskuläre Kalzifizierung erklären. The Factor VII-activating protease (FSAP) is a circulating serine protease of hepatic origin. The single nucleotide polymorphism (SNP) (G534E) called the Marburg I of the FSAP gene (HABP2) can be found in 5% of the western population and is characterized by a decreased enzymatic activity and is associated with various vascular diseases like atherosclerosis, vascular calcification and fibrosis. Previously results of our group showed that FSAP degrades the cystin knot protein platelet derived growth factor (PDGF-BB) resulting in a reduction of vascular smooth muscle cell activation in a mouse model. Because FSAP protein activity has an impact on fibroproliferative and degenerative disease, we addressed the question whether FSAP also regulates members of the structurally related transforming growth factor-& #946; (TGF-& #946;) superfamily of cystin knot proteins. To analyse this, mature growth factors and their respective latent pro-forms were investigated.In this work, members of the bone morphogenetic protein (BMP) and growth and differentiation (GDF) family have been identified as new FSAP substrates, which lead to activation of their osteogenic differentiation and anti-proliferative effects. The effect of FSAP treatment of BMP-2, pro-BMP-2 and pro-GDF-5 was analysed by various in vitro cellular assays. Amino-terminal sequencing showed cleavage of BMP-2 by FSAP treatment and generation of a truncated peptide (R289-K290), which lacked 7 aminoacids. The latent proform of BMP-2 was further cleaved to the mature form (R282-Q283) by FSAP, indicating the same cleavage site as for furin (RXXR). A second cleavage was also observed at the same position as in mature BMP-2. Also the proform of GDF-5 was cleaved and activated by FSAP. The specificity of FSAP induced growth factor activation was further compared with different proteases, indicating that only structurally related plasmin was also an activator. Surprisingly TGF-& #946;-1 was not a candidate for FSAP cleavage.The biological activity of processed BMP-2 was measured by the induction of alkaline phosphatase activity, increased smad1/5/8 phosphorylation and inhibition of proliferation in C2C12 myoblasts. FSAP had a dose- and time dependent stimulatory effect on BMP-2 activity. FSAP induced BMP-2 activity was abolished after treatment with BMP inhibitor Noggin. Besides osteogenic differentiation, FSAP incubation of BMP-2 and pro-BMP-2 also resulted in their enhanced internalization in C2C12 cells. VSMCs responded to FSAP treated BMP-2 and pro-BMP-2 by increased smad1/5/8 phosphorylation and induction of the BMP VSMC target genes Id1 and smad6. To further estimate the role of endogenous FSAP, hepatocytes were transfected with FSAP siRNA. FSAP-dependent BMP-2 and pro-BMP-2 activation was shown and furthermore activated BMP-2 induced target gene expression in hepatocytes, indicating that endogenous FSAP is the major activator of BMP-2 in hepatocytes. To elucidate the specific amino acids involved in FSAP-induced growth factor activation, a mutation study of pro-BMP-2 was performed. Therefore 5 different constructs were cloned, with each one bearing a single site mutation (K278S, R282S, K285S, R282S und K290S) and expressed in HEK293 cells. All mutants were secreted as mature form and to lesser extend as proform in the supernatant. Site mutations of 5 different basic amino acids to nonpolar serine residues did not alter FSAP cleavage indicating that the putative cleavage site requires recognition of more than one residue. A triplemutation study with the pro-BMP-2 variant SSS282 and a mutation in the mature BMP-2 chain SSS289 revealed that only the SSS289 variant was protected from FSAP cleavage. There was a dramatically decrease in SSS282 secretion in HEK293 cells.Here, a new positive regulatory mechanism of the activation of latent and mature BMPs by an extracellular protease has been elucidated. Thus, FSAP is an activator of differentiation- and pro-osteogenic factors. Together with the observation that FSAP induced inhibition of the pro-proliferative PDGF-BB growth factor, FSAP controls proliferation and differentiation of vascular cells favoring a calcification-type phenotype. These reciprocal mechanisms could explain the role of FSAP in fibroproliferative and degenerative vascular diseases like atherosclerosis and vascular calcification.