Identifizierung der CTCFL-Bindestellen in NIH3T3-Zellen und Einfluss der CTCFL-Expression auf die globale Genexpression

Abstract

Die beiden Proteine CTCF und CTCFL weisen eine nahezu identische zentrale 11 Zinkfinger Domäne auf, mit welcher sie in der Lage sind, an spezifische DNA Sequenzen zu binden. Während CTCF in allen somatischen Zellen exprimiert wird, ist die Expression von CTCFL auf wenige Zelltypen in Testis Gewebe beschränkt und kann ansonsten nur noch in Tumorgeweben und einigen Zelllinien in höherer Kopienzahl nachgewiesen werden. Für CTCF sind mehrere Funktionen (transkriptionelle Aktivierung oder Repression, X Inaktivierung, Imprinting) und auch Interaktionspartner (z.B. Cohesin) bekannt. Die Funktionen von CTCFL sind hingegen weniger gut untersucht. Aufgrund der normalerweise strikten Trennung der Expression von CTCF und CTCFL, sowie einer identischen DNA bindenden Zinkfinger Region wird vermutet, dass beide Proteine im Falle gemeinsamer Expression um dieselben Bindestellen konkurrieren. Im Hinblick darauf wird auch diskutiert, ob gerade diese Konkurrenz indirekt durch eine Behinderung der natürlichen Funktionen von CTCF zur Entstehung von Tumoren führt. Um die Funktionen von CTCFL sowie die Auswirkungen der Konkurrenz mit CTCF zu untersuchen, wurden NIH3T3 Klone mit induzierbarer CTCFL Expression (Tet off System) hergestellt. Bei einer genomweiten Untersuchung in einem der Klone zeigten über 400 Gene nach der Induktion von CTCFL eine signifikante Deregulierung ihrer Expression. Diese konnte über individuelle PCR Experimente (RT PCR und real time PCR) für alle untersuchten Gene verifiziert und auch in weiteren Klonen nachgewiesen werden. Einige der deregulierten Gene spielen dabei eine wichtige Rolle während der Spermatogenese. Die Identifizierung der Bindestellen von CTCFL und CTCF in dem für die Genexpressionsanalyse verwendeten Klon zeigte, dass die Bindung von CTCFL und CTCF überlappt. Eine Motivanalyse ergab ein fast identisches Bindemotiv für beide Proteine. CTCF und CTCFL erkennen somit tatsächlich dieselben DNA Sequenzen. An einigen Bindestellen wurde sogar eine Verminderung der CTCF Bindung nach CTCFL Induktion beobachtet. An diesen Stellen könnte es somit tatsächlich zu einer Konkurrenz zwischen CTCF und CTCFL kommen. Weiterhin konnte für mehr als die Hälfte der deregulierten Gene im Gen oder in gennahen Bereichen eine CTCFL Bindestelle detektiert werden, so dass die Deregulation in diesen Fällen ein direkter Effekt der CTCFL Bindung sein könnte. The two proteins CTCF and CTCFL share a nearly identical central 11 zinc finger DNA binding domain. While CTCF is ubiquitously expressed in somatic cells, CTCFL is in general only transcribed in certain parts of the testes. However, expression outside of the testes was detected in various types of cancers. So far, several functions of CTCF, like transcriptional activation or repression, X chromosome inactivation and imprinting as well as interaction partners (e.g. Cohesin) are known. In contrast the functions of CTCFL are quite unclear and less well studied. Due to the mutually exclusive expression patterns of both proteins, together with the nearly identical 11 zinc finger DNA binding domain, it is thought, that if both proteins are expressed in the same cell, they may compete for the same binding sites. In this regard it is also questioned whether this competition might hinder the natural CTCF functions and thereby indirectly lead to the development of cancer.To study the functions of CTCFL and the effects of its putative competition with CTCF, NIH3T3 clones with inducible CTCFL expression (Tet off system) were generated. In a genome wide study more than 400 genes showed a significant deregulation of their expression after induction of CTCFL in a selected clone. This effect was validated by individual experiments (RT PCR and real time PCR) for all genes which were tested. Additionally, the effect was detectable in other clones. Notably, some of the deregulated genes are known to play critical roles in spermatogenesis.The identification of CTCF and CTCFL binding sites in the clone used for the gene expression study, showed a clear overlap between the binding sites of both proteins. Furthermore, the analysis of the binding motifs of CTCF and CTCFL revealed nearly identical DNA sequences both are therefore binding to the same sites. Some of the binding sites also showed a decrease of CTCF binding after induction and binding of CTCFL. At these sites it might be possible that a competition between the two proteins takes place. In Addition more than half of the deregulated genes possess a CTCFL binding site within the gene or in regions adjacent to the gene body. Hence, it is likely that the deregulation of these genes is a direct effect of the CTCFL binding.