Entwicklung, Validierung und Anwendung spurenanalytischer Methoden zum Nachweis von Fluorchinolon-Antibiotika in biologischen Matrices mittels LC-MS/MS

Abstract

Antibiotika sind seit ihrer Entwicklung Anfang des 20. Jahrhunderts in der Veterinär- und Humanmedizin wichtige Pharmazeutika zur Behandlung von Infektionskrankheiten. Jedoch ist parallel zum Antibiotikaeinsatz auch die Anzahl resistenter Mikroorganismen gestiegen. In der Veterinärmedizin werden Antibiotika zur Therapie aber auch zur Metaphylaxe eingesetzt, jedoch unterliegt dieser Einsatz strengen Auflagen. Trotz des Verbotes von Antibiotika als Leistungsförderer im Jahr 2006 nimmt ihr Verbrauch kontinuierlich zu. Im Jahr 2011 wurden über 1700 Tonnen Antibiotika an Veterinäre abgegeben (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 2012). Auch 2012 war die Abgabemenge mit 1619 Tonnen nur unwesentlich geringer (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 2013). Dies kann z. T. auf die erhöhte Nachfrage der Verbraucher an Fleischprodukten und den damit verbundenen Anstieg der Tierbestände zurückgeführt werden. Fluorchinolone sind synthetische Antibiotika, die auf Grund ihrer günstigen pharmakologischen Eigenschaften in der Humanmedizin insbesondere in Form von Ciprofloxacin häufig verschrieben werden. In der Veterinärmedizin hingegen werden sie wegen ihres Status als Reserveantibiotika und ihres vergleichsweise hohen Preises in einem deutlich geringeren Umfang eingesetzt. Über den Zusammenhang zwischen der Aufnahme subtherapeutischer Antibiotikadosen und der damit verbundenen Induktion resistenter Mikroorganismen ist wenig bekannt. Aus diesem Grund ist die Entwicklung und Anwendung sensitiver Methoden zum Nachweis von Fluorchinolonen in biologischen Matrices bei gleichzeitiger Verfolgung der Resistenzentwicklung ein wichtiges Forschungsgebiet. Dazu wurden im Rahmen dieses Projektes Hühner mit sub-therapeutischen Dosen (Simulation von Verschleppungen) und der vom Hersteller empfohlenen Dosis des in der Veterinärmedizin am häufigsten eingesetzten Fluorchinolons Enrofloxacin unter definierten Bedingungen behandelt und die Konzentration u. a. in Faeces- und Plasmaproben bestimmt. In dieser Arbeit wurden neue, selektive und sensitive Methoden zur Extraktion sowie zum Nachweis von Fluorchinolonen mittels LC-MS/MS in biologischen Matrices wie Plasma und Faeces erfolgreich entwickelt. Die Extraktion von Hühnerplasma erfolgte mittels Festphasenextraktion. Hierbei hat sich gezeigt, dass bei der Verwendung von Umkehrphasen auf Polymerbasis die Analytbestimmung von Matrixeffekten beeinflusst wird, die durch einen geeigneten Waschschritt sowie der Verwendung von Methanol als Elutionsmittel im Vergleich zu Acetonitril oder angesäuerten Elutionsmitteln minimiert, jedoch nicht vollständig eliminiert werden. Daher ist eine Kompensation dieser Matrixeffekte erforderlich. Eine Kombination aus Mixed-Mode-Ionenaustauschern zeigte hingegen keine Beeinflussung der Fluorchinolonanalytik durch Matrixeffekte und wurde somit für weitere Untersuchungen verwendet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Phospholipide geeignete Marker zur Evaluierung von Matrixeffekten sind. Die Extraktion von Fluorchinolonen aus Hühnerfaeces ist, auf Grund der starken Sorption dieser Verbindungen an Matrixbestandteile, schwierig. Jedoch konnten die Wechselwirkungen zwischen Matrix und Analyt durch den Zusatz von EDTA während des Extraktionsprozesses minimiert werden. Insgesamt wurden 220 Hühnerfaecesproben unterschiedlicher Behandlungsszenarien auf ihren Gehalt an Enrofloxacin und seines Hauptmetaboliten Ciprofloxacin untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Enrofloxacin hauptsächlich unmetabolisiert ausgeschieden wird, die durchschnittliche Metabolisierung zu Ciprofloxacin jedoch mit steigender Enrofloxacindosis zunimmt. Die beiden Wirkstoffe konnten in Faecesproben bei Gabe von subtherapeutischen Enrofloxacindosen (0,3; 1 und 3 mg/kg Körpergewicht) sowie der vom Hersteller empfohlenen Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht Enrofloxacin mit maximalen Konzentrationen von ca. 60 mg/kg Enrofloxacin und ca. 20 mg/kg Ciprofloxacin bestimmt werden. Beide Antibiotika wurden im Spurenbereich in Kontrollproben detektiert. Dies deutet darauf hin, dass die Aufnahme der Wirkstoffe wahrscheinlich über Verschleppungen, wie z. B. über Stallstaub, erfolgte. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit Faecesproben auf 14 mögliche Enrofloxacin-Metaboliten untersucht, wodurch sich Hinweise auf drei neue Metaboliten, deren Anwesenheit in Vögeln und Säugetieren zuvor nicht in der Literatur beschrieben wurde, ergaben.