Molekulare Charakterisierung von c-Typ- und i-Typ-Lysozymen des Asiatischen Marienkäfers Harmonia axyridis

Abstract

Der Asiatische Marienkäfer Harmonia axyridis (PALLAS, 1773) ist durch seine weltweiten Einwanderungserfolge in den letzten Jahren als Model-Organismus der Invasionsbiologie hervorgetreten. Der ursprünglich in Ostasien beheimatete Marienkäfer wurde als höchst wirksamer Prädator von Blatt- und Schildläusen zur biologischen Schädlingsbekämpfung in Nordamerika und teilen Europas eingeführt und hat sich heutzutage unkontrolliert über die eingeführten Gebiete hinaus bis nach Südamerika und Afrika ausgebreitet. Dieser Invasionserfolg ist unter anderem der ausgeprägten Immunabwehr von H. axyridis zuzuschreiben, die durch ein zweilagiges Immunsystem einen herausragenden Schutz gegen Pathogene bietet. Dieses zweilagige Immunsystem besteht aus der konstitutiv synthetisierten nieder-molekularen antimikrobiellen Substanz Harmonin und induzierbaren antimikrobiellen Peptiden, deren Expression nach erfolgter Infektion hochreguliert wird. Eine wichtige Klasse der antimikrobiellen Peptide sind die zu den hydrolytischen Enzymen zählenden Lysozyme. Bei einer Transkriptomanalyse konnten unter anderem 9 für Lysozyme kodierende Sequenzen in H. axyridis identifiziert werden, wovon 4 der Subklasse der c-(chicken)-Typ-Lysozyme und 5 der i-(invertebrate)-Typ-Lysozyme zuzuordnen sind. Während i-Typ-Lysozyme von Anneliden und Mollusken bifunktionale Enzyme sind, die sowohl eine Isopeptidase-Aktivität als auch eine Muramidase-Aktivität aufzeigen, besitzen die c-Typ-Lysozyme ausschließlich eine Muramidase-Aktivität. Es ist bekannt, dass c-Typ-Lysozyme von Insekten abhängig von der vorliegenden Aminosäuresequenz eine Muramidase-Aktivität aufweisen können, allerdings existieren keine Untersuchungen von i-Typ-Lysozymen aus Insekten. Aus diesem Grund untersuchte die vorliegende Arbeit drei von den vier c-Typ-Lysozymen (c-Lys2, c-Lys3 und c-Lys4) sowie ein i-Typ-Lysozym (i-Lys2) mit Hinblick auf konservierte, katalytische Aminosäurereste, die relevant für eine Muramidase- oder Isopeptidase-Aktivität sind. Sowohl die c-Typ-Lysozyme als auch das i-Typ-Lysozym wurden mit einem c-terminalen His6-Tag modifiziert in der eukaryotischen Hefe Pichia pastoris rekombinant hergestellt und mittels HPLC aufgereinigt. C-Lys2, welchem die katalytischen Aminosäurereste Glu und Ala fehlten, besaß keine Muramidase-Aktivität, während für c-Lys3 und c-Lys4 eine Muramidase-Aktivität gezeigt werden konnte. Die letztgenannten unterschieden sich in ihren theoretischen isoelektrischen Punkten (c-Lys3, pI = 5,46; c-Lys4, pI = 8,18), allerdings lag das pH-Optimum von beiden Lysozymen im leicht sauren pH-Bereich. Weiterhin konnte für beide aktiven c-Typ-Lysozyme eine Calcium-Abhängigkeit gezeigt werden, welche mit dem Vorhandensein einer Asp-reichen Domäne einhergeht. Dieses Sequenzmotiv ist bekannt dafür, dass es eine wichtige Rolle bei der Calcium-Bindung spielt, was bisher nicht auf enzymatischer Ebene für Lysozyme gezeigt wurde. Das rekombinante i-Typ-Lysozym war gegenüber dem Muramidase-Substrat als auch dem Isopeptidase-Substrat inaktiv. Immunhistochemische Färbung und eine Expressionsanalyse mit verschiedenen Organen von H. axyridis ergaben, dass das i-Lys2 im Fettkörper exprimiert und lokalisiert ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass i-Typ-Lysozyme eine noch nicht bekannte Funktion in Insekten einnehmen. Mittels Immunstimulation der Käfer durch Injektion von Bakterien konnte eine 8-fache Hochregulation des c-Lys4-Gens im Darm gezeigt werden, während die Expression von c-Lys3 und i-Lys2 durch Immunstimulation nicht beeinflusst wurde. Weiterhin zeigten weder die rekombinanten c-Typ-Lysozyme c-Lys3 und c-Lys4 noch das i-Lys2 eine antimikrobielle Aktivität gegen zahlreiche getestete Mikroorganismen. Allerdings konnte in einem Bacillus subtilis Wachstumsinhibitionstest die antimikrobielle Aktivität von Harmonin und zwei induzierbaren Ceoloptericinen, die zu AMPs zählen, durch die Zugabe von c-Lys4 verstärkt werden. Die minimalen Inhibitionskonzentrationen verringerten sich nach der Zugabe von c-Lys4 bei Harmonin um das 4-fache und bei den AMPs um das 16-fache. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass zumindest ein katalytisch aktives Lysozym (c-Lys4) Teil des hoch effizienten Immunsystems ist, welches ein wichtige Rolle bei der erfolgreichen Invasion von H. axyridis einnimmt. The invasive ladybird beetle Harmonia axyridis was introduced as a biological control agent into agricultural systems and spread uncontrolled into new areas. One reason for its successful invasion is his two-layered immune system. The first layer features the constitutive production of the low-molecular-mass antimicrobial compound harmonine and the second layer is the induceable production of a broad range of antimicrobial peptides (AMPs). This protects him effectively against pervasive pathogens. Belonging to the AMP genes five c-type lysozymes and four i-type lysozymes were identified in H. axyridis. Prototypical i-type lysozymes from Annelida and Mollusca are chimeric bifunctional enzymes with both muramidase and isopeptidase activity in contrast to the other lysozyme types which display only muramidase activity. Insect c-type lysozymes are known to exhibit muramidase activity, whereas i-type lysozymes from insects have not been analyzed on protein level thus far. This study focused on three out of four c-type lysozymes, namely c-lys2, c-lys3 and c-lys4, and on one i-type lysozyme, namely i-lys2, which possess or lack the conserved amino acids residues responsible for muramidase or isopeptidase activity of the enzymes. The c-type lysozymes as well as the i-type lysozyme were modified with a c-terminal his6-tag and heterologously expressed by the yeast P. pastoris.For the c-type lysozymes two were supposed to have a muramidase activity, c-lys3 and c-lys4, while two missing the important amino acid residues Glu and Ala. C-lys2 lacking the conserved Glu and Ala residues displayed no muramidase activity at all. C-lys3 and c-lys4 differ substantially in their theoretical isoelectric points (pI = 5.46 and pI = 8.18), however both pH optima of the purified enzymes were in the slightly acidic pH range. Further we could demonstrate that activity of both lysozymes were Ca2+ dependent in line with the presence of a conserved Asp-rich domain in their sequence. This sequence is known to play a role in calcium binding but has not been shown for lysozymes so far. The recombinant i-type lysozyme was inactive in both muramidase and isopeptidase assays. Immunofluorescence and expression analysis revealed that the i-type lysozyme is produced in the fat body of H. axyridis. These data suggest that i-type lysozymes in insects have acquired novel not-yet-identified functions in the course of evolution. Immune stimulation of the beetles induced an 8-fold up-regulation of c-lys4 gene expression in the gut, whereas the c-lys3 and i-lys2 genes were expressed at comparable levels in both naïve and immune stimulated beetles. No antimicrobial activity could be shown either for c-lys3, c-lys4 nor for i-lys2, but in a Bacillus subtilis growth inhibition assay the antimicrobial activity of harmonine and two highly-inducible H. axyridis AMPs (coleoptericins) was potentiated in the presence of c-lys4, resulting in 4-fold (harmonine) and up to a 16-fold (AMP) lower minimum inhibitory concentrations. Our results suggest that at least one catalytically active lysozyme is part of the highly efficient immune system of H. axyridis and is considered to represent an adaptation enhancing the evolutionary success of this species.