Funktion von DNER und AQP1 in der Pathogenese der Osteoarthrose

Abstract

Bei der Osteoarthrose handelt es sich um eine multifaktorielle Erkrankung, deren Pathogenese mit der Degeneration des hyalinen Gelenkknorpels beginnt und sich während des Verlaufs auf weitere Teile des Gelenks ausbreitet. Neben dem altersbedingten Gelenkverschleiß sind Gelenkfehlstellungen, vorhergehende Verletzungen, Übergewicht, das weibliche Geschlecht aber auch genetische Faktoren wesentliche Risikofaktoren (Spector, 2004; Hunter und Felson, 2006). Die Osteoarthrose stellt weltweit ein immer stärkeres ökonomisches Problem dar, da der demographische Wandel die Anzahl der an Osteoarthrose erkrankten Patienten erhöht, jedoch die Krankheit bis heute nicht heilbar ist. Die Therapiemaßnahmen beschränken sich auf Schmerzreduktion und Erhalt der Beweglichkeit, was in der Spätphase der Erkrankung meist mit dem Ersatz des betroffenen Gelenks einhergeht (Bloom et al., 2008). Um die Symptome der Erkrankung zukünftig besser therapieren zu können bzw. um den Erhalt des Gelenks zu ermöglichen, müssen die zugrundeliegenden molekularbiologischen Prozesse während der Pathogenese besser verstanden werden. Um weitere Erkenntnisse über die pathogen veränderte Molekularbiologie während der Knorpeldegeneration zu erlangen, wurde in der vorhergehenden Arbeit von Geyer et al., (2009) eine vergleichende Genexpressionsanalyse makroskopisch lädierter und nicht-lädierter Areale des osteoarthrotischen humanen Kniegelenkknorpels durchgeführt. Neben vier weiteren Genen (IGFBP-3, WISP-1, DAF, CIF) konnte eine Überexpression des Wasserkanals AQP1 als auch des Notch-Liganden DNER in den makroskopisch lädierten Bereichen beobachtet werden.Darauf aufbauend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der Notch-Rezeptor-Ligand DNER auch auf Proteinebene eine erhöhte Expressionsrate in den stärker lädierten Knorpelarealen im Vergleich zu den weniger lädierten Bereichen aufweist. Die erhöhte Expression war überwiegend in der Oberflächenzone zu beobachten, wo in vorhergehenden Studien chondrozytäre Vorläuferzellen lokalisiert werden konnten, welche neben einem erhöhten Migrations- und Proliferationsverhalten auch eine erhöhte Expressionsrate des Rezeptors Notch aufwiesen (Alsalameh et al., 2004; Dowthwaite et al., 2004). Um den Einfluss von DNER auf den Kniegelenksknorpel untersuchen zu können, wurde DNER in kultivierten humanen osteoarthrotischen und gesunden Chondrozyten überexprimiert und der Einfluss auf unterschiedliche Stoffwechselparameter, aber auch auf Mitglieder des Notch-Signalwegs untersucht. Die Überexpression von DNER zeigte keinen Einfluss auf die adulten Chondrozyten, was eine Expression von DNER in den chondrozytären Vorläuferzellen vermuten ließ. Da diese Progenitorzellen in der Lage sind, zu Chondrozyten-ähnlichen Zellen zu differenzieren, wurde die Funktion von DNER innerhalb der in vitro Chondrogenese untersucht. Hierfür wurden humane mesenchymale Stammzellen mit einem DNER überexprimierenden Plasmid nukleofiziert und die Expression unterschiedlicher Stoffwechselparameter, Transkriptionsfaktoren und Mitglieder des Notch-Signalwegs analysiert. Dies ergab, dass DNER die Hypertrophie des Gewebes begünstigte, indem es zu einer deutlichen Überexpression der Hypertrophie-Marker Kollagen Typ X und von MMP13 in den DNER exprimierenden Zellen, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene kam. Unterstrichen wurde dies durch die erhöhte Expression der Aggrekanasen ADAMTS-4 und ADAMTS-5, welche ebenfalls mit dem hypertrophen Phänotyp in Verbindung stehen (Thirunavukkarasu et al., 2007; Solomon et al., 2008). Die DNER-überexprimierenden Zellen zeigten auch eine höhere Apoptoserate und eine Reprimierung des MMP- und Aggrekanasehemmers TIMP-3. Ob der Einfluss von DNER durch die Interaktion mit dem Rezeptor Notch einhergeht, müsste in weiteren Studien näher untersucht werden, da in den DNER überexprimierenden Zellen der Rezeptor Notch-1 leicht reprimiert und im Gegensatz dazu der Rezeptor Notch-2 leicht hochreguliert wurde.Obwohl AQP1 ebenfalls in der Oberflächenzone des osteoarthrotischen Knorpels nachgewiesen wurde, konnte der Einfluss von AQP1 auf die Expression unterschiedlicher Stoffwechselparameter und Transkriptionsfakoren aber auch auf Gerüstproteine, welche mit dem Migrationsverhalten der Zellen in Verbindung stehen, nicht gezeigt werden. Da die Chondrozyten eine Vielzahl an Transportkanälen besitzen, welche an der Volumenregulation beteiligt sind, ist eine Kompensation des AQP1-Effektes als Ursache hierfür denkbar (Barrett-Jolley, 2010). Osteoarthritis is a multifactorial joint disease which is based on the degeneration of the hyaline cartilage but also affecting other parts of the joint. Beside the age-related degeneration of the joint, other causes including previous injuries, overweight, female gender and genetic factors are key risk factors (Spector, 2004; Hunter and Felson, 2006). Osteoarthritis represents a substantial economic problem due to the demographic change and the associated increasing number of patients to be expected in the future. The disease is still incurable, and the therapeutical options are limited to pain relief and to the maintenance of physical mobility (Bloom et al., 2008). To avoid joint replacement surgery and treatment options of the osteoarthritic symptoms, the underlying pathogenic processes have to be better understood. In the previous work of Geyer et al., (2009) a differential gene expression analysis of macroscopically intact versus affected human OA articular cartilage samples was performed. It was found that beside four other genes (IGFBP-3, WISP-1, DAF, CIF) the genes for the water channel AQP1 and the notch-receptor-ligand DNER were upregulated in the affected areas.Based on the previous results we could show for the first time that the DNER protein is overexpressed in the superficial zone of the macroscopically affected articular cartilage. Next we overexpressed DNER in cultured osteoarthritic and normal human chondrocytes and analysed the influence on specific cartllage metabolic parameters and members of the notch-signaling pathway. Because there were no measurable effects on mature chondrocytes we assumed that DNER could be expressed in mesenchymal progenitor cells located in the superficial zone of the articular cartilage. These cells differentiate to chondrocyte-like cells and have a high potential for migration and proliferation. Additionally Dowthwaite et al., (2004) showed that these progenitor cells overexpress Notch-1. To investigate the role of DNER on these chondrocyte-like cells, we overexpressed DNER in human mesenchymal stem cells and measured matbolic- and transcription factors and members of the notch-signaling during in vitro chondrogensis. The result of the experiment was that DNER favored the hypertrophic phenotype of the tissue by upregulating collagen type X and MMP13. The results were supported by the upregulation of the aggrecanases ADAMTS 4 and ADAMTS-5, which are known to be associated with the hypertrophic phenotype (Thirunavukkarasu et al., 2007; Solomon et al., 2008). The DNER expressing cells also showed a higher rate of apoptosis and a reduction of the main MMP- and aggrecanase inhibitor TIMP-3. If DNER interacts with the receptor Notch has to be examined in further studies, since there was only a slight downregulation of Notch-1 and an upregulation of Notch-2 in the DNER-expressing cells.Although AQP1 was expressed in the superficial zone of the articular cartilage of OA patients, we could not observe any influence on metabolic parameters, transcription factors or on structure proteins known for a role on cell migration.