Mechanismen der epigenetischen Inaktivierung von tumorassoziierten Genen in humanen Lungentumoren

Abstract

Der epigenetischen Deregulation von tumorassoziierten Genen kommt in der Pathogenese von Lungentumoren eine zentrale Bedeutung zu. Insbesondere sind CpG- und GC-reiche Sequenzen, die als CpG Inseln (CGI) bezeichnet werden, häufig aberrant methyliert. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Bisulfit-Konvertierung genomweite DNA-Methylierungsprofile von 480.000 CpGs in humanen Lungenkrebszelllinien und normalen bronchialen Epithelzellen generiert. Es zeigte sich, dass vor allem intra- und intergenische CGI in Lungenkrebszelllinien höher als in normalen Epithelzellen methyliert sind. Die funktionelle Annotation von lungenkrebsspezifisch hypermethylierten CGI ergab, dass diese signifikant mit Homöobox-Domänengenen und Genen, die in Stammzellen repressive H3K27me3 Histonmodifikation tragen, assoziiert sind. Zwischen den untersuchten Lungenkrebszelllinien zeigten sich sowohl bei der Analyse aller CpGs, als auch bei promotorassoziierten, intra- oder intergenischen CGI starke Unterschiede bei der Streuung der Methylierungsdaten und im mittleren Methylierungsniveau. Die stärksten Methylierungsdifferenzen zwischen verschiedenen Lungenkrebszelllinien konnten in zwei kb langen Übergangsbereichen von CGI, den sogenannten shores festgestellt werden. Im Gegensatz dazu lagen in normalen Lungenzellen kaum Schwankungen der shore-Methylierung vor. Interessanterweise konnte eine Korrelation zwischen der Transkriptionsrichtung (5´-3´) und der Methylierung von CGI nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass 5´-shores von Transkriptionsstart-assoziierten CGI in Lungenkrebszelllinien und normalen Lungenzelllinien signifikant höher (p < 0,001) methyliert sind als 3´-shores. Diese shore-spezifische Hypermethylierung konnte anhand der Promotor-CGI des Tumorsuppressorgens Ras Association Domain Family 1A (RASSF1A) in Lungentumoren verifiziert werden. Weiterhin zeigte sich auf Grundlage der genomweiten DNA-Methylierungsprofile von Lungenkrebszellen, dass downstream gelegene CGI-Promotoren innerhalb von zwei Tandem-orientieren Genen, eine Prädisposition zur Hypermethylierung aufwiesen. Die Intensität der CGI-Hypermethylierung korrelierte signifikant mit der Länge des intergenischen Bereichs zwischen solchen Tandemgenen. Da das RASSF1A Gen ebenfalls als ein downstream gelegenes Tandemgen vorliegt, wurde der epigenetische Inaktivierungsmechanismus des RASSF1A Promotors mit Hilfe eines induzierbaren Tandemreporter-Assays untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion der Transkription eines upstream gelegenen Reportergens zu einer Repression des downstream gelegenen Gens und zu einer Deacetylierung der Histone im RASSF1A-Promotorbereich kommt. Als Faktoren, die an der Ausbildung dieses repressiven Effekts beteiligt sind, konnten HDAC6 und CPSF1 identifiziert werden. In Lungenkrebszellen ließ sich außerdem eine tumorspezifische Zunahme der Expression von Histondeactylasen, Faktoren des Polycomb-repressiven Komplexes und der DNA-Methylierungsmaschinerie im Vergleich zu normaler Lungen nachweisen. Um die therapeutische Wirkung von DNA-Methyltransferase/DNMT-Inhibitoren zu analysieren, wurden Lungenkrebszelllinien vier Tage lang mit den Cytosin-Analoga Zebularin bzw. 5-Aza-2´-Desosxycytidin (5-Aza-2´-dC) behandelt. Durch den Einsatz von Zebularin konnte eine stärkere Hemmung der Zellproliferation als durch 5-Aza-2´-dC erzielt werden. Die Demethylierungseffizienz einer 200 microM Zebularin Behandlung war jedoch signifikant niedriger als die von 5 micro M 5-Aza-2´-dC. Der Vergleich von demethylierten CpGs nach Zebularin- und 5-Aza-2´-dC-Behandlung ergab eine signifikante Überschneidung gemeinsam demethylierter CpGs. Die Analyse der Methylierungsprofile der Lungenkrebszelllinien führte zur Identifizierung von aberrant methylierten Genen. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die tumorspezifische Hypermethylierung des ATP-binding cassette sub-family B member 4 (ABCB4) Transporters verifiziert. Bei einer umfassendenMethylierungsanalyse von verschiedenen Krebsentitäten konnte eine Hypermethylierung des ABCB4 CGI-Promotors in Lungen-, Brust-, Hals- und Kopfkrebszellen festgestellt werden. Diese Methylierung war mit einer Reduktion der ABCB4 Genexpression verbunden und konnte unter Verwendung von DNMT-Inhibitoren reaktiviert werden. In murinen Krebszelllinien wurde ebenfalls eine krebsspezifische epigenetische Inaktivierung von Abcb4 detektiert werden. Eine Überexpression von ABCB4 in humanen Lungenkrebszelllinien zeigte einen repressiven Effekt auf die Kolonieformation und die Zellproliferation. Im Rahmen dieser Arbeit wurden epigenetischen Regulationsmechanismen, die bei der Inaktivierung von tumorassoziierten Genen involviert sind, in Lungenkrebs identifiziert. Die Bedeutung der Befunde konnten anhand von verschiedenen Genen und Chromatin-assoziierten Faktoren verifiziert werden. The epigenetic deregulation of tumor-associated genes is of central importance in the pathogenesis of lung tumors. In particular CpG and GC-rich sequences, known as CpG islands (CGI), are frequently aberrantly methylated. In the present work, genome-wide DNA-Methylation profiles of 480,000 CpGs in human lung cancer cell lines and normal bronchial epithelial cells after bisulfite conversion were generated. It was observed that especially intra- and intergenic CGI are methylated higher in lung cancer cell lines than in normal epithelial cells. The functional annotation of specifically hypermethylated CGI in lung cancer revealed that the hypermethylation is significantly associated with homeobox domain genes and genes that contribute to repressive histone H3K27me3 in stem cells.Strong differences in the distribution of methylation and the average methylation levels were seen in the examined lung cancer cell lines concerning both the analysis of all CpGs, as well as promoter associated, intra- or intergenic CGI. The strongest variations of methylation in various lung cancer cell lines were seen in 2 kb long transitional areas of CGI, the so-called shores. In contrast, barely any variation of the shore methylation was detected in normal lung cells. Interestingly, a correlation between the direction of transcription (5´ 3´) and the methylation of CGI were detected. The 5´-shores of transcription start-associated CGI in lung cancer cell lines and normal lung cell lines were significantly higher (p < 0.001) methylated than 3´-shores. This shore-specific hypermethylation could be verified on the basis of the promotor CGI of the Ras Association Domain Family 1A (RASSF1A) tumor suppressor in lung tumors.On the basis of genome-wide DNA-Methylation profiles of lung cancer cells, a predisposition to hypermethylation of downstream located CGI promoters within two tandem oriented genes was shown. The intensity of the CGI hypermethylation correlates significantly with the length of the intergenic region between such tandem genes. Since the RASSF1A gene is also a downstream tandem gene, the epigenetic inactivation of RASSF1A was examined with an inducible reporter assay using the tandem RASSF1A promoter. By means of this assay, it was determined that the induction of transcription of a reporter gene located upstream led to a repression of the downstream gene and deacetylation of histones in the RASSF1A promoter region. HDAC6 and CPSF1 were identified as factors involved in this repressive effect. Furthermore, a tumor-specific increase in the expression of histone deactylases, factors of the polycomb repressive complex and the DNA-Methylation machinery were detected in lung cancer cells compared to normal lung cells. To analyze the therapeutic effect of DNA-methyltransferases (DNMT) inhibitors, lung cancer cell lines were treated for four days with the cytosine analogs Zebularine and 5-Aza-2´-deoxycytidine (5-Aza-2´-dC). The use of Zebularine caused a stronger inhibition of cell proliferation than 5-Aza-2´-dC. However, the efficiency of demethylation after treatment with 200 microM Zebularine was significantly lower than the treatment with 5 microM 5-aza-2´-dC. A significant overlap of the demethylated CpGs after treatment with Zebularin- and 5-Aza-2´-dC was revealed. The analysis of methylation profiles of lung cancer cell lines led to the identification of aberrantly methylated genes.In a further part of this work, the tumor-specific hypermethylation of ABCB4 (ATP-binding cassette sub-family B member 4) transporter was verified. In a comprehensive analysis of various cancer entities, the hypermethylation of the CGI promoter of ABCB4 in lung, breast, head and neck cancer cells was detected. The hypermethylation in these cells was associated with a reduced gene expression and a re-expression of ABCB4 was induced with DNMT inhibitors. Further, in murine cancer cell lines a cancer-specific epigenetic inactivation of Abcb4 was detected. Overexpression of human lung cancer cell lines in ABCB4 showed a repressive effect on the colony formation and cell proliferation.In this work, epigenetic regulatory mechanisms that are involved in the inactivation of tumor-associated genes were identified in lung cancer. The significance of the findings could be verified for different genes and chromatin-associated factors.