Photoreaktivierung und Genregulation durch CryB aus Rhodobacter sphaeroides

Abstract

Photolyasen reparieren UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPD) oder (6-4)-Photoprodukte in der DNA durch den lichtabhängigen Prozess der Photoreaktivierung. Sie sind nah verwandt mit den Cryptochromen, die als Blaulicht-Photorezeptoren regulatorische Funktionen ausüben. Mitglieder der Cryptochrom/Photolyase-Familie (CPF) sind in allen Domänen des Lebens vertreten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Cryptochrom CryB aus Rhodobacter sphaeroides aus der Untergruppe der FeS-BCP neben seiner regulatorischen Funktion auch eine Reparaturaktivität zur Spaltung von (6-4)-Photoprodukten besitzt. Damit kann CryB den dual-function-Mitgliedern der CPF zugeordnet werden.Durch den Austausch von Aminosäuren konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der drei Cofaktoren von CryB bei der Photoreaktivierung gewonnen werden. Der Fokus lag dabei auf in vivo Untersuchungen der CryB-Varianten im Knockout-Stamm R. sphaeroides & Delta;cryB. Es wurde festgestellt, dass der Elektronentransferweg über die Tryptophan-Diade, die essenziell für die in vitro Reduktion des FAD und die Reparaturfunktion von CryB ist, für die in vivo Photoreaktivierung verzichtbar ist. Der in der CPF neuartige Antennenchromophor 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ) ist bei geringen Lichtintensitäten von Bedeutung für eine effiziente Reparatur. Die Entfernung oder Beeinträchtigung einer der lichtabsorbierenden Cofaktoren, FAD oder DLZ, bewirkte keinen Funktionsverlust, jedoch eine stark verringerte Effizienz der Photoreaktivierung. Die Beeinträchtigung beider Cofaktoren zusammen durch Mutagenese verringerte die CryB-abhängige Photoreaktivierungsfähigkeit auf das Level von & Delta;cryB.Ein Eisen-Schwefel-Cluster kommt als Cofaktor von Photolyasen und Cryptochromen nur in der FeS-BCP-Untergruppe vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Cluster für die strukturelle Integrität des Proteins unverzichtbar ist. Seine Funktion bei der DNA-Reparatur oder bei regulatorischen Prozessen ist nicht abschließend geklärt, dies bedarf weiterer Untersuchungen.Die Kultivierung verschiedener cryB-Knockoutstämme in An- und Abwesenheit von Antibiotika hat ergeben, dass Kanamycin einen deutlich stärkeren Einfluss auf den kanamycinresistenten Stamm & #8710;cryB hat, als dies bei anderen kanamycinresistenten Stämmen der Fall ist. Der Stamm zeigt vermutlich aufgrund einer eingeschränkten Expression seines Resistenzgens eine erhöhte Sensitivität gegenüber Kanamycin. Ein zuvor unter mikroaeroben Bedingungen beobachteter Phänotyp ist somit wahrscheinlich auf einen durch Kanamycin beeinflussten Effekt zurückzuführen.CryB interagiert mit dem Photorezeptor AppA. Durch Interaktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Proteine wahrscheinlich an ihren jeweiligen C-Termini miteinander interagieren. Eine Co-Kristallisation war bislang nicht erfolgreich; weitere Versuche können in Zukunft Aufschluss über Details der Interaktion geben. Photolyases repair UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) or (6-4) photoproducts in DNA through the light-dependent process of photoreactivation. They are closely related to the cryptochrome blue light photoreceptors, which carry out regulatory functions. Members of the cryptochrome/photolyase family (CPF) are present in all domains of life. This study demonstrates that Rhodobacter sphaeroides cryptochrome CryB, belonging to the sub-group of FeS-BCP, exhibits a repair activity allowing cleavage of (6-4) photoproducts in addition to its regulatory function. Thus, CryB can be assigned to the dual function members of the CPF.Through amino acid exchanges, new insights about the role of the three cofactors of CryB in photoreactivation were obtained. The focus of this work was on in vivo investigations of the CryB variants in the knockout strain R. sphaeroides & Delta;cryB. It was found that the electron transfer pathway via a tryptophane diad, which is crucial for in vitro reduction of FAD and the repair function of CryB, is not required for in vivo photoreactivation. The novel antenna chromophore of the CPF, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ), is of importance for an efficient repair at low light intensities. Removal or impairment of one of the two light-absorbing cofactors, FAD or DLZ, did not cause a loss of function, but strongly affected the efficiency of photoreactivation. The impairment of both cofactors together through mutagenesis decreased CryB-dependent photoreactivation to the level of & Delta;cryB.The occurence of an iron-sulfur cluster as a cofactor of photolyases and cryptochromes is restricted to the FeS-BCP sub-group. It could be shown that the cluster is indispensable for the structural integrity of the protein. Its function in DNA repair or in regulatory processes has not yet been conclusively settled, this requires further investigations.The cultivation of different knockout strains of CryB in presence or absence of antibiotics has shown that kanamycin has a much stronger influence on the kanamycin-resistant strain & #916;cryB than on other strains resistant to kanamycin. This strain shows an increased sensitivity towards kanamycin, probably due to a decreased expression of its resistance gene. A phenotype previously observed under microaerobic conditions thus probably results from a kanamycin-induced effect.CryB interacts with the photoreceptor AppA. Interaction analyses could show that both proteins probably interact at their respective C-termini. A co-crystallisation has not been successful, but further attempts may give information about details of their interaction in the future.