Biochemische und molekularbiologische Studien zum Melaninabbau mittels versatiler Peroxidase aus Irpex consors

Abstract

In der vorliegenden Arbeit konnten sieben Basidiomyceten identifiziert werden, welche in der Lage waren, Melanin in Agarplatten abzubauen. Der Basidiomycet mit der höchsten Peroxidaseaktivität, Irpex consors, wurde ausgewählt und in weiteren Studien untersucht. Durch Submerskultivierung von Irpex consors wurde Kulturüberstand gewonnen, welcher mehreren Reinigungsschritten unterzogen wurde. Nach Ammoniumsulfatfällung, Filtrierschritten und zweistufiger FPLC-Reinigung mit einem schwachen Anionentauscher sowie mit Größenausschlusschromatographie konnte das Zielenzym isoliert werden. Die molekulare Masse wurde mittels denaturierender SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung zu 47 kDa ermittelt. Der isoelektrische Punkt wurde mittels isoelektrischer Fokussierung mit nachfolgender Coomassie- und ABTS-Aktivitätsfärbung zu 3,5 bestimmt. In den Untersuchungen zur Enzymcharakterisierung wurde ein pH-Optimum von 3,6, eine optimale Umsetzungstemperatur von 50 °C, sowie eine optimale Wasserstoffperoxidkonzentration von 35 µM bestimmt. Durch tryptischen Verdau und anschließende MALDI-TOF-MS/MS wurde das Enzym identifiziert. Es wurde als eine beim Ligninabbau durch Imami et al. (2015) bereits untersuchte versatile Peroxidase identifiziert. Der N-Terminus der publizierten Aminosäurensequenz wurde mittels Edman-Abbau verifiziert.Die Peroxidaseaktivität im Kulturüberstand von Irpex consors wurde mit verschiedenen Substraten wie Melanin, der Calcium-Sulfitablauge BretaxCl, Vanillin, Oxalsäure, Gallussäure, Dimethoxyphenol, Veratrylalkohol und Ferulasäure induziert. Die Induktion der Peroxidaseproduktion durch das Substrat Melanin wurde auf molekularbiologischer Ebene durch RT-qPCR über Berechnung anhand dreier Referenzgene nachgewiesen.Ein 2-Enzym-System wurde etabliert, bei welchem Wasserstoffperoxid kontinuierlich in-situ durch eine Glucoseoxidase produziert wurde. Die Parameter des 2-Enzym-Systems wurden optimiert und erfolgreich auf Melaninabbau in einem Modellsystem übertragen. Durch dieses 2-Enzym-System wurde Melanin deutlich effektiver abgebaut als durch Zugabe von Wasserstoffperoxid.Die Analyse des Substratspektrums der versatilen Peroxidase erfolgte mit den natürlichen Farbstoffen Bixin, Indigokarmin, Curcumin und & #946;-Carotin, welche von der versatilen Peroxidase erfolgreich umgesetzt wurden. Die flüchtigen, aromarelevanten Abbauprodukte von & #946;-Carotin wurden mittels head-space solid phase micro extraction (HS-SPME) sowie mittels stir bar sorptive extraction (SBSE) extrahiert und anschließend gaschromatographisch-massenspektrometrisch untersucht. Dabei wurden die Abbauprodukte & #946;-Ionon, & #946;-Cyclocitral, 5,6-Epoxy-& #946;-ionon und Dihydroactinidiolid identifiziert.Quantifizierungen der Abbauprodukte & #946;-Ionon und & #946;-Cyclocitral erfolgten durch Ermittlung des Responsefaktors des verwendeten internen Standards Thymol. In this study seven basidiomycetes were identified, which were capable of degrading melanin in solid-state fermentation. Due to the high activities in peroxidase assays, the basidiomycete Irpex consors was chosen for further analysis. The supernatant of Irpex consors was treated by various clean-up steps. After ammonium sulfate precipitation, filtration and a two-step fast protein liquid chromatography comprising weak anion exchange and size exclusion, the pure enzyme was isolated.The molecular mass was determined via SDS-PAGE and Coomassie-staining and was determined to be 47 kDa. The isoelectric point was determined by isoelectric focusing with subsequent staining by either Coomassie or ABTS-activity-staining and was found to be 3,5.The isolated peroxidase showed a pH-optimum of pH 3,6 as well as a temperature-optimum of 50 °C. The concentration of hydrogen peroxide was best at 35 µM.By tryptic digestion with subsequent MALDI-TOF-MS/MS analysis, the enzyme was identified as a versatile peroxidase, which had previously been studied in a project on lignin- degradation (Imami et al. 2015). The N-terminus of the previously published amino acid sequence of this versatile peroxidase was confirmed by Edman-sequencing.The peroxidase activity in the culture supernatant was enhanced significantly by addition of numerous substrates like melanin, vanillin, oxalic acid, gallic acid or ferulic acid.The induction of peroxidase activity by melanin was studied on a molecular basis. By calculation with three reference genes, the enhanced expression of the mRNA encoding the versatile peroxidase by cultivation with melanin could be proven by reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).A 2-enzyme-system was successfully established, where the essential hydrogen peroxide was produced in-situ by a glucose oxidase. The parameters of this system were optimized which then was used for melanin bleaching. It was shown that the degradation of melanin via the 2-enzyme-system was successful and significantly more efficient than directly adding hydrogen peroxide.To study the degradation of other possible substrates, the versatile peroxidase was screened for its bleaching potential of the natural dyes bixin, curcumin, indigo carmine and & #946;-carotene. All substrates were bleached successfully. The volatile degradation products of & #946;-carotene were extracted by head-space solid phase micro extraction (HS-SPME) and stir bar sorptive extraction (SBSE) and subsequently analysed by gas chromatography coupled to mass-spectrometry. Four degradation products were identified: & #946;-ionone, & #946;-cyclocitral, 5,6-epoxy-& #946;-ionone and dihydroactinidiolide.Quantitation was carried out by using the internal standard thymol. After determination of the response factors by construction of an external calibration curve, the degradation products & #946;-ionone and & #946;-cyclocitral were quantified.