Untersuchung der humanen Coronavirus-induzierten Wirtsreaktion auf mRNA- und Proteomebene

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, diese Mechanismen am Beispiel des humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E) systematisch auf den Ebenen der Transkription, der Translation und der posttranslationalen Modifikationen an Proteinen zu charakterisieren. Initial wurden mehrere vergleichende microarray Experimente in A549 Lungenkarzinomzellen und HuH7 Leberkarzinomzellen durchgeführt, um zeitabhängige, replikationsabhängige und Zelllinien unabhängige Veränderungen in infizierten Zellen zu determinieren. Diese Analysen umfassten Experimente, in denen infizierte Zellen von nicht infizierten Zellen über Lasermikrodissektion separiert wurden. Overrepresentation analysis (ORA) und genes set enrichment analysis (GSEA) zeigten, dass innerhalb der Gruppe der deregulierten Gene verschiedene Signalwege angereichert sind. Die am stärksten angereicherten Signalwege umfassen den Stress Signalweg des endoplasmatischen Retikulums (ER), den nuclear factor & #954;-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-& #954;B) Signalweg, sowie Gene der mitochondrialen Atmungskette. Bei einem Vergleich von HCoV-229E und Interleukin-1 (IL-1) induzierte Genexpressionsänderungen, konnten inflammatorische Mediatoren als charakteristische Zielgene für beide Bedingungen identifiziert werden. Der deutlich größere Teil der HCoV-229E regulierten Gene zeigte keine Überlappung mit einer IL-1 Stimulation, was impliziert, dass die virale Infektion eine breitere Wirtszellantwort induziert als das prototypische proinflammatorische IL-1. Loss of function Experimente zeigten, dass die NF-& #954;B Untereinheit p65 und TNFAIP3 (beides Komponenten des NF-& #954;B Signalweges) essentielle Wirtsfaktoren für die viral vermittelte Expressionsinduktion von NF-& #954;B Zielgenen (wie IL8 und CXCL2) sind. Interessanterweise unterstützen beide Faktoren auch die optimale virale Replikation, da deren knockdowns die virale Transkription hemmen. Der TNFAIP3 knockdown hemmt außerdem die Translation des viralen nucleocapsid (N) Proteins.Im zweiten Teil der Arbeit wurde die viral induzierte Wirtsantwort auf den Ebenen des Proteoms und der posttranslationalen Modifikationen mittels markierungsfreier Massenspektrometrie charakterisiert.Die Analyse offenbarte, dass mehrere virale Proteine Ziel von zum Teil kombinierten Acetylierungen, Phosphorylierungen und Ubiquitinierungen sind. Mit neu generierten phosphorylierungsspezifischen Antikörpern und zellpermeablen Proteinkinaseinhibitoren wurde gezeigt, dass zwei Phosphorylierungen am viralen N Protein von eine Kinase des ER Stress Signalweges (PERK) und von einer MAP Kinase (JNK) reguliert werden. Die Inhibition beider Kinasen führte außerdem zu verringerten viralen Titern. Auf Seiten des Wirtsproteoms wurden mehrere tausend Peptide identifiziert, die Acetylierung, Phosphorylierungen und Ubiquitinierungen tragen. Von diesen wurde ein signifikanter Teil HCoV-229E abhängig differentiell reguliert. Die bioinformatische Analyse dieser Daten offenbarte eine Vielzahl von zellulären Strukturen und Prozessen, die von der Infektion auf Proteinebene beeinflusst werden. Dazu zählen unter anderen die Kernpore sowie Proteine, die an der Acetylierung von Histonen oder an der Übertragung von Ubiquitinketten beteiligt sind. Außerdem konnten mehrere regulierte posttranslationale Modifikationen an Proteinen nachgewiesen werden, die in processing (P)-bodies lokalisiert sind. Funktionelle Experimente zeigten, dass sich P-bodies im Verlauf der Infektion auflösen. Um dieses Phänomen zu charakterisieren, wurde eine reprimierte Phosphorylierung an EDC4 experimentell bestätigt und über phosphorylierungsspezifische Antikörper und EDC4 Mutanten untersucht. Die ektopische Expression einer phosphomimetischen EDC4 Mutante beeinflusste die virale Replikation nicht. Im Gegensatz dazu führte der EDC4 knockdown zu einer schwachen Hemmung der viralen N Protein Synthese. Darüber hinaus konnte die N Protein Synthese durch den knockdown der P-body Komponente DCP1a zelltypspezifisch verstärkt oder gehemmt werden. Diese Daten belegen eine bisher unbekannte Beteiligung von P-body Proteinen an der HCoV-229E Replikation. Weitere mechanistische Untersuchungen des DCP1a Proteins zeigten, dass dieses konstitutiv über den TRAF6 Signalweg ubiquitiniert wird.Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit einer der systematischsten und umfassendsten bisher zur Verfügung stehenden Datensätze zur zellulären Reaktionen auf eine Coronavirus Infektion generiert. Diese Hochdurchsatz-Datensätze stellen eine Grundlage für weiterführende Analysen der tiefgreifenden Effekte einer HCoV-229E Infektion auf das Wirtszelltranskriptom und -proteom dar. Mechanistische Experimente zur Untersuchung des ER Stress Signalweges, des NF-& #954;B Signalweges und des decapping/P-body Signalweges unterstreichen die Relevanz diese essentiellen Wirtszellsignalwege sowohl für die virale Replikation, als auch für die inflammatorische und metabolische Wirtsantwort. The aim of this thesis was to characterise the host cell gene response to the human coronavirus 229E (HCoV-229E) systematically at the level of transcription, translation and posttranslational modifications of proteins. Initially, multiple comparative microarray experiments were performed in A549 lung carcinoma and HuH7 liver carcinoma cells to reveal time-dependent, replication-dependent and cell type-independent changes of the transcriptomes of infected cells. This included a detailed analysis of virus-infected cells that were separated from non-infected cells by laser microdissection. Overrepresentation analyses (ORA) and gene set enrichment analyses (GSEA) revealed that deregulated gene sets were enriched for genes of multiple pathways. The most prominently deregulated pathways comprised the endoplasmic reticulum (ER) stress response, the nuclear factor & #954;-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-& #954;B) pathway as well as genes of the mitochondrial respiratory chain. A comparison of gene expression changes induced by HCoV-229E infection with those of the proinflammatory cytokine interleukin-1 (IL-1) revealed a small overlapping set of genes mainly encoding inflammatory mediators. However, far more genes were solitarily regulated by HCoV-229E indicating that virus infection induces a much broader host cell gene response than IL-1. Loss of function experiments showed that the NF-& #954;B subunit p65 as well as TNFAIP3 (both components of the NF-& #954;B pathway) are essential host factors not only required for virus-mediated induction of NF-& #954;B target genes (such as IL8 or CXCL2) but unexpectedly also support optimal replication as their knockdowns led to repressed viral transcription. The TNFAIP3 knockdown also caused a decrease in viral N protein translation.In the second part of this thesis the viral host response was also assessed at the level of the proteome and of posttranslational modifications using label free mass spectrometry. This analysis uncovered that several viral proteins are targets of combined acetylation, phosphorylation and ubiquitination. By means of newly generated phosphorylation-site specific antibodies and cell permeable protein kinase inhibitors it was shown that two phosphorylation sites at the viral nucleocapsid (N) protein are phosphorylated by the ER stress kinase PERK and the MAP kinase JNK. Inhibition of both kinases also resulted in reduced viral titers. Within the host cell proteome, several thousand peptides carrying acetylations, phosphorylations or ubiquitinations were identified. A significant part of these peptides were differentially modified in response to the HCoV-229E infection. Bioinformatic analyses revealed a large number of cellular compartments and processes that were affected by the infection at the protein level. Examples include the nuclear pore complex, proteins involved in the acetylation of histones or in the attachment of ubiquitin chains. Moreover, several proteins localising in processing (P)-bodies were found to carry virus-regulated posttranslational modifications. Functional experiments showed that P-bodies disintegrate during the course of HCoV-229E infection. To characterise this phenomenon, a repressed phosphorylation site at the structural P-body component EDC4 was experimentally confirmed and investigated in more detail using phospho-specific antibodies and specific EDC4 mutants. However, ectopic expression of phospho-mimicking variants of EDC4 did not affect viral replication. In contrast, EDC4 knockdown led to a weak reduction in viral N protein synthesis. Moreover, knockdown of another P-body component, DCP1a, also suppressed or enhanced viral N protein translation in a cell-type dependant manner. These data revealed a new contribution of P-body proteins to HCoV-229E replication. Further mechanistic studies of the DCP1a protein showed that it is constitutively ubiquitinated by TRAF6-dependent pathway.In summary, the data obtained during this thesis represent one of the most systematic and comprehensive studies of the cellular response to CoV infections available to date. These omics data provide a rich resource for continuing studies of the profound and broad effect of a HCoV-229E infection on the host cell transcriptome and proteome. Further mechanistic experiments targeting the ER stress response, the NF-& #954;B pathway and the decapping/P-body pathway highlight the relevance of these major host cell pathways for viral replication as well as inflammatory and metabolic host cell gene responses.