Charakterisierung der molekularen Mechanismen der K-Ras/Akt-regulierten Motilität sowie der Funktion von Akt-Effektoren in Karzinomzelllinien mit onkogenem K-Ras

Abstract

Die Proteinfamilie der Akt-Kinasen besteht aus drei Mitgliedern, namentlich Akt1, Akt2 und Akt3. Die Akt-Kinasen sind hauptsächlich in der Regulation der Zellproliferation, des Überlebens, des Metabolismus und der Zellmigration involviert. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass nach stabiler Expression von onkogenem K-Ras(V12) die Ausbildung eines invasiven und motilen Phänotyps der Pankreaskarzinomzelllinie PANC-1 induziert wurde. Die Aktivierung des Phosphoinositid-3-Kinase(PI3-K)/Akt-Signalweges wurde dabei als essentiell für die K-Ras(V12)-induzierte Zellmotilität identifiziert. Die Analysen der vorliegenden Arbeit wiesen in EGFP-K-Ras(V12)-exprimierenden PANC-1- Zellklonen eine veränderte Expression der Akt-Isoformen sowie eine basal erhöhte Akt3-Aktivität nach. Aufbauend darauf wurden die individuelle Expression und Aktivität der Akt-Isoformen in etablierten Pankreas- und Lungenkarzinomzelllinien analysiert. Die Expressionsanalysen zeigten eine differentielle Akt1-, Akt2- und Akt3-Expression. In isoformspezifischen in vitro Akt-Kinase-Assays konnte in den Lungenkarzinomzelllinien COLO-699 und H23 eine deutliche, epidermal growth factor (EGF)-induzierte Akt3-Aktivität detektiert werden, während in PANC-1 Zellen alle Akt-Isoformen in unterschiedlicher Stärke durch EGF aktiviert wurden. Für die Akt-Isoformen ist bekannt, dass sie eine individuelle Rolle in der Zellmigration in Abhängigkeit von der Zelllinie einnehmen können. Daher wurde in Wounding-Assays die Rolle der Akt-Kinasen und der einzelnen Akt-Isoformen in der Migration analysiert. In Assays mit PANC-1 und COLO-699 Zellen konnte nach Behandlung mit einem pan-Akt-Inhibitor eine deutlich verminderte Migration dokumentiert werden. In weiteren Studien wurden Akt1, Akt2 und Akt3 siRNA-vermittelt depletiert. Die Akt1-Depletion inhibierte die Migration von PANC-1 Zellen, PANC-1/EGFP-K-Ras(V12)-Zellklonen und H23 Zellen. Die Depletion von Akt2 oder Akt3 zeigte keinen Effekt auf die Migration dieser Zellen, mit Ausnahme von PANC-1/EGFP-K-Ras(V12)-Zellklonen, deren Motilität nach Akt2-Depletion gehemmt wurde. Um die zugrundeliegenden Akt-abhängigen Signalwege zu charakterisieren, wurden die Zellen mit spezifischen Inhibitoren und dem Akt-Aktivator SC-79 behandelt. In den Analysen von COLO-699 und PANC-1 Zellen konnten S6 und MDM2 als Akt-Substrate identifiziert werden. Um weitere Akt-Effektoren zu identifizieren, wurde ein Phospho-Akt-Substrat Proteom-Scan mit SC-79-behandelten H23 Zellen durchgeführt. In dieser Analyse konnten über 700 putative Akt-regulierte Phosphopeptide ermittelt werden. Einige dieser Akt-Effektoren sind an der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts beteiligt und könnten daher für die Migrationsregulation von Bedeutung sein. Insgesamt konnte somit erstmals ein K Ras(V12)-abhängiger Effekt auf die Akt-Isoform-Expression und Akt3-Aktivität gezeigt werden und die Rolle der Akt-Isoformen in der Migration als auch die Akt-abhängige Signaltransduktion in Pankreas- und Lungenkarzinomzellen näher charakterisiert werden. The Akt family of protein kinases consists of three members, namely Akt1, Akt2 and Akt3. These kinases are mainly involved in the regulation of cell proliferation, survival, metabolism and cell migration. It was shown by our group, that stably expressed oncogenic K-Ras(V12) induces the development of an invasive and motile phenotype of the pancreatic carcinoma cellline PANC-1. Activation of the phosphoinositide-3-kinase (PI3-K)/Akt pathway was shown to be fundamental for K-Ras(V12)-induced cell migration. It was uncovered within this project, that PANC-1/EGFP-K-Ras(V12) cell clones display an altered expression of the Akt isoforms and an enhanced Akt3 activity. Based on these data, the individual expression and activity of the three Akt isoforms were investigated in established pancreatic and lung cancer cell lines. Expression analyses revealed a diverse expression pattern of Akt1, Akt2 and Akt3 in these cell lines. To characterize the individual activity of the Akt isoforms, isoform-specific in vitro Akt-kinase-assays were performed. Treatment with epidermal growth factor (EGF) induced a prominent Akt3 activity in COLO-699 and H23 lung cancer cells. The analysis of PANC-1 cells revealed a distinct, EGF-induced activity of Akt1, Akt2 and Akt3. Since the three Akt kinases are known to play individual roles in controlling cell migration of several other carcinoma cell lines, the role of the Akt kinases and the distinct Akt isoforms in cell migration were investigated in wound healing assays. The application of a pharmacological pan-Akt-inhibitor led to a strongly reduced cell motility of PANC-1 and COLO-699 cells. In further studies specific siRNA pools targeting the Akt isoforms were applied. The silencing of Akt1 reduced the migration rate of PANC-1, PANC-1/EGFP-K-Ras(V12) cell clones and H23 cells. Silencing of Akt2 and Akt3 did not affect the motility of the analyzed cells, with exception of PANC-1/EGFP-K-Ras(V12) cell clones showing a reduced migration rate upon Akt2 depletion. To characterize the underlying signal transduction pathways PANC-1, H23 and COLO-699 cells were treated with specific inhibitors and the Akt-activator SC-79. In studies of COLO-699 and PANC-1 cells S6 and MDM2 were identified as Akt-regulated effectors. To uncover other Akt-regulated effectors, SC-79-treated H23 cells were analyzed in a phospho-Akt-substrate proteomic screen. These studies revealed more than 700 putative Akt-regulated phosphopeptides, including proteins involved in the reorganization of the actin cytoskeleton. Thus, these proteins might be important for the regulation of migration. In summary this work showed for the first time a K-Ras(V12)-dependent effect on Akt isoform expression and Akt3 activity. Furthermore, the role of the Akt isoforms in cell migration of pancreatic and lung cancer cell lines was characterized and Akt-dependent signal transduction pathways were clarified.