Kontrolle der monozytären Interleukin-1beta-Freisetzung durch alpha1-Antitrypsin

Abstract

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Freisetzung des pro-inflammatorischen Zytokins Interleukin- 1beta (IL-1 beta) aus Monozyten. Die Freisetzung von IL-1beta kann zur Entstehung einer systemischen Entzündungsreaktion beitragen und bedarf daher einer strengen Kontrolle. Das Akute-Phase- Protein alpha1-Antitrypsin (AAT) hat neben seiner Funktion als Anti-Protease vielfache, anti- inflammatorische Eigenschaften, die während einer schweren Operation eingeschränkt sein könnten. AAT ist z.B. in der Lage, die IL-beta-Freisetzung aus Monozyten zu inhibieren, wenn diese durch die Aktivität des P2X Purinozeptor 7 (P2X7) induziert wurde. Der P2X7-Rezeptor wird durch die Wahrnehmung des extrazellulären Gefahrensignals ATP aktiviert und führt zur Assemblierung eines intrazellulären Inflammasomkomplexes, dem NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 (NALP3)-Inflammasoms, welches wiederum die Reifung und Freisetzung von IL-1beta veranlasst. AAT kann die Aktivierung des P2X7-Rezeptors und durch ATP verhindern, was zur Inhibition der ATP-induzierten IL-1beta-Freisetzung führt. AAT benötigt für diese Inhibition die Aktivität des scavenger-Rezeptors CD36 und der Ca2+-unabhängigen Phospolipase-A2beta (iPLA2beta). Nach heutiger Auffassung führt die Aktivität der iPLA2beta zur Freisetzung von Phosphatidylcholinmetaboliten, die durch die monozytären Zelllinie U937 freigesetzt werden und eine metabotrope Aktivität von niktoniergen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) induzieren. Die nAChR-Aktivierung inhibiert wiederum den P2X7-Rezeptor. Die Identität dieses cholinergen Faktors (Faktor-x) ist bis heute unklar.Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob AAT während einer kardiopulmonalen Bypass(CPB)-Operation die Fähigkeit verliert, die ATP-induzierte IL-1beta-Freisetzung aus U937- Zellen zu inhibieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen deuten darauf hin, dass die inhibitorische Kapazität von AAT auf die ATP-induzierte IL-1beta-Freisetzung leicht abnimmt, diese Abnahme vermutlich jedoch keine physiologische Konsequenz hat. Die Anti-Proteasefunktion von AAT scheint durch eine CPB-Operation ebenfalls keine gravierenden Veränderungen zu erfahren. Jedoch konnte festgestellt werden, dass der Oxidationszustand des Proteins entscheidend für die Inhibition der ATP-induzierten IL-1beta-Freisetzung ist.Weiterhin wurde sich der Identität des cholinergen Faktors gewidmet, der durch AAT aus U937- Zellen freigesetzt wird. Potenzielle Kandidaten des Faktor-x wurden mit Hilfe von siRNA- Technologie und spezifischen Antagonisten gegen nAChR-Untereinheiten untersucht. Die Spaltprodukte der iPLA2beta 1-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und Glycerophosphocholin wurden aufgrund von abweichenden Rezeptorbedürfnissen disqualifiziert. Docosahexaensäure, eine freie Fettsäure, die bei der Spaltung von Phosphatidylcholinen durch iPLA2beta freigesetzt werden kann, inhibiert zwar die ATP-induzierte IL-1beta-Freisetzung, ist jedoch nicht der gesuchte Faktor-x. Die Aufklärung des Faktor-x ist für die entwicklung neuer Therapeutika sehr erstrebenswert, da er die Eigenschaft besitzt, selektiv metabotrope nAChR-Funktionen zu induzieren, jedoch keine ionotropen nAChR-Funktionen. Kommerzielle AAT-Präparate zur Prävention systemischer Entzündungen einzusetzen, ist aufgrund der hohen Verfügbarkeit und geringen Nebenwirkungen von besonderem Interesse, bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. The release of the pro-inflammatory cytokine interleukin-1beta (IL-1beta) by monocytes can contribute to the development of a systemic inflammation and therefore requires strict control. In addition to its function as an anti-protease, the acute phase protein alpha1-antitrypsin (AAT) has multiple anti- inflammatory properties that can be potentially be impaired by major surgery. AAT is able to inhibit IL-beta release from monocytes, when induced by P2X7 receptor activation. The P2X7 receptor is activated by the perception of the extracellular danger signal ATP and leads to the assembly of an intracellular inflammasome complex, the NACHT, LRR and PYD domains- containing protein 3 (NALP3) inflammasome. The NALP3-inflammasome, in turn, facilitates the maturation and the release of IL-1beta. AAT can prevent the activation of the P2X7 receptor and thus the perception of ATP. For the inhibition of the ATP-induced release of IL-1beta, AAT requires the activity of the scavenger receptor CD36 and the Ca2+-independent phosphatase A2beta (iPLA2beta). According to the current concept, the activition of iPLA2beta results in the production of metabolites of phosphatidylcholines, which are released by the monocytic cell line U937 and induce metabotropic functions of nicotinic acetylcholine receptors (nAChR). The molecular identity of this cholinergic factor (factor-x) is still unknown.The present work investigated whether AAT loses the ability to inhibit the ATP-induced IL-1beta release by U937 cells during cardiopulmonary bypass (CPB) surgery. The results of these studies indicate that the inhibitory capacity of AAT on ATP-induced IL-1beta release is slightly decreased, which is presumably without any physiological consequence. The anti-protease function of AAT remains unchanged by CPB surgery as well. However, it was found that the oxidation state of the protein is crucial for the inhibition of the ATP-induced IL-1beta release.Furthermore, the factor-x released from U937 cells upon stimulation with AAT was investigated. Potential candidates were examined using siRNA technology and specific antagonists for nAChR subunits. The iPLA2beta cleavage products 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine and glycerophosphocholine were disqualified due to receptor requirements different from factor-x. Docosahexaenic acid, a free fatty acid that can be released by iPLA2beta when phosphatidylcholines are cleaved, inhibits the ATP-induced IL-1beta release, but also differs from factor-x. Identifying factor-x may be interesting for the devolopment of novel therapeutics, since it selectively provokes metabotropic nAChR functions while avoiding ionotropic functions. Due to thier availability and few side effects, the use of commercial AAT preparations for the prevention of systemic inflammation is of particular interest.