Die protektive Wirkung von Cyclosporin A während der Ischämie und der Reperfusion Untersuchungen am global ischämischen Hundeherzen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es die protektive Wirkung,sowie die dazugehörigen Wirkungsmechanismen von Cyclosporin A (CsA)an einemLangzeitischämie-Modell beim Hund zu untersuchen.Hierzu wurden zwölf Spenderherzen während einer 18stündigen globalen Ischämieunter hypothermen Bedingungen mit 'University of Wisconsin '(UW)-Lösung perfundiert und anschließend 6 Stunden von einemEmpfängertier reperfundiert.Dabei wurden sechs Herzen mit CsA (10 -5 mol/l) behandelt,während die unbehandelten Organe als Kontrolledienten.Die vor (A) und nach (B)der Ischämie sowie nach zwei (C)bzw.sechs (D)Stunden Reperfusion entnommenen Biopsien wurdenanschließend histologisch untersucht. Außerdem wurden im Verlauf der Reperfusionsphase stündlich Funktionsparameter bestimmt,deren Auswertung die protektive Wirkungvon CsA zeigte. Während sich die kontraktile Funktion in der behandelten Gruppe vollständig erholte,erreichte die endsystolischeElastizität der unbehandelten Herzen nur 50% der Kontrollwerte. Im zweiten Teil der Studie sollten die möglichen Ursachen für die protektiven Effekte von CsA erforscht werden,wobei sich folgendeResultate ergaben: Im Elektronenmikrokop zeigten die meisten Präparate nach der 18stündigen Ischämie eine reversible Schädigung.Allerdings war derSchädigungsgrad in den mit CsA perfundierten Herzen weitaus geringer. Weiterhin wurde in keinem der Präparate elektronenmikroskopische Anzeichen nekrotischer Zellen gefunden.Dafür spricht auch diefehlende Markierung nach der Complement C9 Färbung. Im Gegensatz dazu stieg der mittels TUNEL-Methode bestimmte Anteil an apoptotischen Zellen zum Ende der Reperfusion signifikant auf5,9%in der unbehandelten Gruppe.Diese Apoptoserate wurde durch die Gabe von CsA um mehr als 50%auf 2,4%gesenkt.Im weiterenVerlauf wurden die Ergebnisse der TUNEL-Methode durch die Resultate der Lamin B1-Färbung bestätigt.Während die Reduktion vonLamin B1-positiven Kernen in der D-Biopsie der CsA-freien Gruppe 93%betrug,fiel der Anteil in der CsA-Gruppe auf 97%.Die gleicheTendenz ergab sich aus der Lamin A-Färbung,wobei der Anteil an negativen Kernen nach 6stündiger Reperfusion bei 27%(ohneCsA)bzw.5%(mit CsA)lag. Um die genauen Mechanismen der Protektion zu erforschen,wurden verschiedene Proteine mittels der Western Blot-Technikausgewertet.Dabei ergab insbesondere die quantitative Auswertung des mitochondrialen Cytochrom C-Gehaltes zum Ende der Ischämieeinen signifikanten Unterschied.Während das partikuläre Cyto- chrom C in den mit CsA perfundierten Herzen nur auf 73%derAusgangsmenge fiel,verringerte sich der Gehalt ohne CsA auf 48%.Dagegen reduzierte sich derGehalt an Bax-Protein erst nach 6Stunden Reperfusion auf 65%(ohne CsA)bzw. 71%(mit CsA).Gleiches galt für das Bcl-2-Protein,wobei die Gesamtmenge nach derIschämie leicht anstieg,bevor der Gehalt zum Ende der Reperfusion auf 70% ohne und 81%mit CsA abfiel. Entsprechend verringerte sich die Gesamtmenge an Calcineurin nach 6stündiger Reperfusion auf 64%(ohne CsA)bzw.72%(mit CsA)derAusgangsmenge. Allerdings führte die Perfusion der Herzen mit CsA zu einer vollständigen Hemmung der Calcineurinaktivität während derIschämie und der Reperfusion, während die Enzymaktivität ohne die Behandlung mit CsA erst nach 6 Stunden Reperfusion auf 70%derAusgangsaktivität fiel. In Bezug auf alpha-Aktinin und Aktin konnten im Western Blot keine Mengen- unterschiede zwischen den einzelnen Zeitpunkten festgestelltwerden.Hingegen zeigte die immunhistochemische alpha-Aktinin-Markierung in den C-und D- Biopsien beider Gruppen offensichtlicheVeränderungen,die sich als Areale mit aufgelöster und diffuser Querstreifung darstellten. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse eine deutliche protektive Wirkung von CsA,die in Kombination mit Hypothermie undUW-Lösung zu einer drastischen Verbesserung der funktionellen und strukturellen Erholung nach Langzeitischämie und Reperfusion führt. Dabei verringert CsA einerseits die in der CsA-freien Gruppe auftretenden ischämischen Beschädigungen,andererseits reduziert CsAsignifikant die im Verlauf der Ischämie eingeleitete Apoptose. Beide Effekte werden maßgeblich durch die CsA-bedingte Hemmung der Ca 2+ - abhängigen mitochondrialen 'permeability transition'-Pore verursacht.Dadurch verhindert CsA die Schwellung der Mitochondrien und die Freisetzung des Apoptoseinduktors CytochromC.Außerdem blockiert CsA die pro-apoptotische Wirkung von Calcineurin durch die vollständige Enzymdeaktivierung. Als CsA-unabhängig erwiesen sich die Proteine der Bcl-2-Familie.In beiden Versuchsgruppen änderte sich das Konzentrationsverhältniszwischen den pro-und anti-apoptotischen Mitgliedern der Familie zugunsten des anti-apoptotischen Bcl 2 s.Hieraus resultiert vermutlichdie geringe Apoptoserate trotz der 18stündigen Ischämie. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf eine herausragende Rolle von CsA bei der Entwicklung neuer kardioplegischer Lösungen für dieHerzaufbewahrung bei humanen Transplantationen hin,wobei neben der Vergrößerung des Donorpools vor allem die schnellere Erholungdes Organs von Bedeutung wäre. Inwiefern andere Mechanismen (z.B.IAP oder NO)an der Verbesserung der Ischämietoleranz beteiligt sind,muss in zukünftigen Versuchenuntersucht werden. Cyclosporine A,an immunosuppressive cyclic undecapeptide initially isolated from Tolypocladium inflatum gams ,has been widely used forthe treatment of allograft rejection. The aim of the study was to determine a possible protective role against ischemia and to clarify the working mechanisms of cyclosporine A(CsA)in a canine cardiac long-term ischemia model.Therefore twelve dog hearts were perfused with 'University of Wisconsin '-solutionduring18 hours of hypothermic global ischemia. In six hearts,CsA was added to the cardioplegic solution and the others were used ascontrol.After 18 hours,the hearts were transplanted into the recipient dogs to reestablish blood perfusion.During the following six hours fourbiopsies were taken: before transplantation (A),at the end of preservation (B),after two hours (C),and after six hours of reperfusion. Furthermore,the end-systolic elastance was calculated during the reperfusion period to measure functional recovery with the addition ofCsA.The function recovered to 55%in the CsA-free group,whereas recovery increased to 100%in CsA-treated hearts. To further elucidate the cause for these protective effects histomorphological investigations were performed with the following results: The degree of ischemic damage was determined by electron microscopy.Although most of the hearts showed reversible injury,the degreeof damage was elevated in the group without CsA. Electronmicroscopic evidence for necrosis was not observed.This correlates with the absence of positive complement C9 labeling in allbiopsies. In contrast to necrosis,6%of the total number of myocytes in the untreated group were apoptotic (TUNEL-positive)after 6 hours ofreperfusion.This rate significantly decreased to 2,4%when CsA was added to the cardioplegic solution. These findings were confirmed byLamin B1-staining where a loss of 7%of Lamin B1 positive nuclei was detected in the D-biopsie of non treated hearts in comparison to3%in the treated group.Corresponding results were found concerning the number of Lamin A negative nuclei.Their number increased to27%(without CsA) and to only 5%(with CsA)at the end of the reperfusion period. To elucidate the working mechanisms of the substance in detail,Western Blot analysis of different proteins was performed.In particular,thequantitative evaluations of mitochondrial cytochrome c showed in a significant difference between both groups.After 18 hours ofischemia,the amount of cytochrome c wasreduced to 48%in CsA-free dogs in comparison to 73%in dogs treated with CsA.In contrast,thetotal amount of Bax showed no significant changes until the end of the reperfusion period.At this time point,the amount of protein wasreduced to 65% (without CsA)and 71%(with CsA),respectively.The same decrease after 6 hours of reperfusion was valid for Calcineurinand Bcl-2,whereby the total quantity of Bcl-2 moderately increased during ischemia before reaching 70%without and 81%with the additionof CsA at the end of reperfusion.Calcineurin decreased from 100%to 64%in the CsA free-group and to 72%in CsA perfused hearts. Another important finding is the fact,that calcineurin activity was completely blocked during ischemia and reperfusion in the CsA-treatedgroup.In comparison, the activity decreased to 70%at the end of the experiment in untreated hearts. To study a damaging effect of ischemia/reperfusion on structural proteins Western blot-analysis and histomorphology for alpha-actinin andactin were carried out.No differences were found between the total amount of protein at the four time points but fluorescent labeling ofalpha-actinin showed areas with diffuse alpha-actinin labeling in the majority of C-and D-biopsies. In conclusion,these results demonstrate protective effects of CsA in combination with hypothermia and UW-solution which lead to a drasticincrease in functional and structural recovery after longterm ischemia and reperfusion. Moreover,the addition of CsA diminished on the one hand the degree of ischemic damage as well as significantly reduced the rate ofapoptotic cells. Both mechanisms were caused by stabilization of the mitochondrial permeability transition pore through CsA thereby preventing themitochondrial swelling and the release of the apoptotic inducer cytochrome c.Furthermore,the CsA-induced blockade of calcineurin activityinhibits the pro-apoptotic effects of calcineurin. The present results prove that the principal working mechanisms of the Bcl-2- family are independent of CsA.In both groups,the ratiobetween the pro-apoptotic and anti-apoptotic-members of this family changed towards the anti-apoptotic Bcl 2.This might be the reasonfor the occurrence of a small number of apoptotic cells after 18 hours of global ischemia. In summary this data indicates a potential role for CsA in cardioplegic solutions used in transplantation of human hearts.Consequently,theaddition of CsA could expand the donorpool and improve the functional recovery after heart trans- plantations.