Die Rolle von endogenem FGF-1 bei akutem Herzinfarkt : eine Studie an FGF-1 transgenen Mäusen

Abstract

Die Koronare Herzerkrankung ist eine weit verbreitete Erkrankung in vielen Ländern der Welt. In den Industrieländern ist sie eine derhäufigsten Erkrankungen. Die Wahrscheinlichkeit, bleibende Schäden davonzutragen, bzw. dieser Erkrankung zu erliegen ist sehr hoch. Eine der Hauptfolgen der Koronaren Herzerkrankung ist der myokardiale Infarkt. Um in der Lage zu sein, ein geeignetes und effektivesMittel hiergegen zu entwickeln, ist es unabdingbar, die Pathophysiologie und die ihr zugrunde liegenden Mechanismen genau zu kennen. Eine seit einiger Zeit stark diskutierte mögliche Therapieform stellt die Applikation von Wachstumsfaktoren dar. Bisher waren die meistenStudien auf die Gabe von exogenen Wachstumsfaktoren fokusiert. Im Gegensatz hierzu ist über die Effekte von endogenenWachstumsfaktoren wenig bekannt. Erste Versuche lassen jedoch vermuten, daß Unterschiede zwischen endogenen und exogenenWachstumsfaktoren bestehen. Einer der in Frage kommenden Wachstumsfaktoren ist der saure Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF-1). Die hier vorliegendeDoktorarbeit basiert auf zwei Fragen: Erstens, würde eine permanente Überexpression von FGF-1 noch stets kardioprotektiv sein und fallsja, wie lange? Und zweitens, würde diese Kardioprotektion durch einen angiogenen oder durch einen trophischen Effekt ausgelöstwerden? Um diese Fragen zu klären, wurden im Vorfeld transgene Mäuse entwickelt, die das humane FGF-1 herzspezifisch überexprimieren. DieseMäuse waren lebensfähig, zeigten eine normale Entwicklung und vergleichbare Zuchtresultate. Bezüglich der Anatomie, derHistomorphologie und der Ultrastruktur zeigten diese transgenen Mäuse keine wesentlichen Abweichungen. Während die kapilläre Dichtevergleichbar war, wiesen die transgenen Tiere mehr Koronararterien auf. Vorallem die Arteriolen wiesen eine erhöhte Dichte auf.Außerdem waren in den transgenen Tieren mehr Abzweigungen von den Haupt-Koronarien nachweisbar. Zusätzlich war dieKoronarperfusion am isolierten Herzen in den transgenen Tieren erhöht. Diese Resultate zeigen bereits, daß FGF-1 eine wichtige Rolle inder Differenzierung und dem Wachstum des koronären Systems besitzt. Es läßt auch den Schluß zu, daß FGF-1 eines derhauptverantwortlichen regulatorischen Moleküle bei der Differenzierung des arteriellen Systems ist. Desweiteren konnte mit diesemtransgenen Modell deutlich gezeigt werden, daß endogenes FGF-1 zumindest bei Normoxie keinen angiogenen Effekt hat. Um unsere Hypothese eines nicht-vaskulogenen kardioprotektiven Effekts von FGF-1 zu überprüfen, wurden diese FGF-1 transgenenMäuse entweder einer kurzen lokalen ischämischen Periode von 15-75 Minuten oder einer einwöchigen lokalen Ischämie ausgesetzt. Wirfanden eine deutlich verzögerte Infarktentwicklung in den transgenen Mäusen im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Wurfgeschwistern.Während in den Wildtyp-Tieren erste Infarkte schon nach 15 Minuten sichtbar waren, war dies in den transgenen Tieren erst nach 45Minuten der Fall. Die maximale Infarktgröße von ca. 60% des Risikogebietes war in beiden Genotypen vergleichbar. Während diese in denWildtyp-Tieren bereits nach 45 Minuten Ischämie nachweisbar war, benötigten die transgenen Tiere 75 Minuten um gleiche Infarktgrößenauszubilden. Diese Verzögerung in der Infarktentwicklung wurde ebenfalls in in vitro Versuchen deutlich beschrieben. Hierbei zeigten adulteKardiomyozyten eine signifikant geringere Freisetzung von Kreatin Kinase (CK) und Laktat Dehydrogenase (LDH). Die verzögerte Infarktentwicklung kann zumindest teilweise einer konstitutiv erhöhten Expression der extrazellulär signal-reguliertenKinasen ERK-1 und ERK 2 zugeschrieben werden. Diese sind in den transgenen Herzen bereits ohne Ischämie zu einem höherenProzentsatz aktiviert. Zusätzlich resultierte die Injektion des ERK-1/-2 Inhibitors UO126 in einer Abschwächung des kardioprotektivenEffekts von FGF-1. In früheren Experimenten konnte bereits gezeigt werden, daß ERK-1 und ERK-2 eine wesentliche Rolle in derischämischen Präkonditionierung spielen. Da eine angiogene/arteriogene Wirkungsweise zu einer Reduzierung der maximalen Infarktgröße aufgrund eines erhöhten Koronarflusseshätte führen müssen (die arterioläre Dichte war in den transgenen Herzen erhöht), gehen wir davon aus, daß die Kardioprotektion auf einennicht-vaskulären Effekt zurück zu führen ist. Anhand von Tieren mit einwöchiger lokaler Ischämie untersuchten wir den Einfluß einer konstitutiven kardialen Überexpression von FGF-1auf die Herzfunktionen und das Remodeling im Wundgewebe und dem übrigen Myokard. Der kardiale Index (CI) sank sowohl in dertransgenen als auch in der Wildtyp-Gruppe nach dem experimentellen Eingriff ab. In den FGF/MI Tieren waren sowohl der basale als auchder maximale CI niedriger als in den Wildtyp-Tieren. Bezüglich der kapillären Dichte konnten wir keine Unterschiede zwischen denGenotypen beobachten. Die Tatsache, daß die kardialen Myozyten der transgenen Tiere eine geringere Dichte bei einer gleichzeitigenGrößenzunahme aufwiesen, weist auf eine hypertrophe Antwort des nicht-infarzierten Gewebes hin. Zusätzlich konnten in den FGF-1transgenen Tieren höhere Apoptoseraten und geringere Kollageneinlagerungen im Wundgewebe nachgewiesen werden. Die DNSSynthese wies jedoch keine Unterschiede auf. Daher schlußfolgern wir, daß die kardiale Überexpression eine Verschlechterung derHerzfunktionen und eine Veränderung des kardialen Umbaus nach einem einwöchigen experimentellen Infarkt bewirkt. Zusammenfassend können wir sagen, daß eine konstitutive, herzspezifische Überexpression von FGF-1 einen kardioprotektiven Effektausübt und das Überleben der Zellen erhöht. Für diesen protektiven Mechanismus wird der Signaltransduktionsweg der ischämischenPräkonditionierung genutzt. Zusätzlich verschlechtert es jedoch die funktionelle Wiederherstellung des Herzens nach einem längerenmyokardialen Infarkt. Bisher zeigten die meisten tierexperimentellen und klinischen Studien, daß sowohl die Gabe von FGF-1, als auch dieGabe oder Überexpression von FGF-2, eine positive Wirkung während einer kardialen Ischämie haben. Über die Effekte von FGF-1 beiGabe zu Beginn der Reperfusion ist jedoch noch nichts bekannt. Für eine Behandlung von Patienten nach einem akuten Herzinfarkt ist diesjedoch Voraussetzung. Gesetzt den Fall, daß die Gabe von FGF-1 auch nach einer Wiederherstellung des Koronarflusses vorteilhaft wäre,könnte es z.B. zusätzlich zur thrombolytischen Therapie gegeben werden. Dies könnte von Vorteil sein, da bereits bekannt ist, daß nicht nurdie Ischämie selbst, sondern - in einem höheren Maße sogar - die einer Ischämie folgende Reperfusion Schaden in dem Risikogebietinduziert. Die Gabe von FGF-1 könnte hierbei u.U. die Infarktgröße reduzieren und die Wiederherstellung der Herzfunktionen günstigbeeinflussen. Im Gegensatz hierzu ist ein positiver Effekt von endogenem FGF-1 in Patienten, die an einem akuten Myokardinfarkt leiden, fraglich.Unsere Daten zeigen nämlich neben einer deutlichen Verzögerung der Infarktentwicklung auch einen nicht zu unterschätzenden negativenEffekt - die deutliche Verschlechterung des myokardialen Umbaus und der Herzfunktionen. Zusätzlich bietet unser Mäusemodell ein gute Möglichkeit, um die Signalkaskade von FGF-1 besser und genauer zu erforschen.Zusammen mit unseren Kollegen in Maastricht waren wir bereits in der Lage zu zeigen, daß der kardioprotektive Effekt in unseremtransgenen Mäusemodell weder an einen angiogenen noch an einen arteriogenen Mechanismus zu koppeln ist. Wir konnten jedoch zeigen,daß der kardioprotektive Effekt FGF-Rezeptor-1 vermittelt ist, während dies bei der durch FGF-1 ausgelösten Zellprotektion nicht der Fallist. Desweiteren konnten wir nachweisen, daß der kardioprotektive Effekt dem der ischämischen Präkonditionierung ähnelt, und sowohl derFGF-Rezeptor 1, als auch die Protein Kinase C, die Tyrosin Kinasen und die MAPKinasen ERK-1 und -2 hieran beteiligt sind. Heart failure is a common syndrome with an increasing incidence and prevalence. It is already one of the leading causes of morbidity,disability and mortality in the developed world. One of the major causes of heart failure is myocardial infarction. Understanding of thepathophysiology and underlying mechanisms is imperative and a major requirement for the development of adequate therapy. Onepossible therapy that is discussed is the application of growth factors. Most studies on this subject have focused on the effects ofapplication of exogenous growth factors. In contrast little is known about the effect of endogenous growth factors. However, first resultssuggested that there would be differences between endogenous en exogenous ones. One of the discussed growth factors is fibroblastgrowth factor-1 (FGF-1). The present thesis focuses on two different subjects: First, would a permanent overexpression of FGF-1 still beprotective and for what timeperiod? And second, would this be mediated by an angiogenic effect or as we hypothesized by a trophic effect. Therefore we generated transgenic mice with a cardiac specific overexpression of the human FGF-1. These mice were viable, showed anormal development and breeding results. Anatomic, histomorphological, and ultrastructural analyses revealed no major morphological ordevelopmental abnormalities of transgenic hearts. Capillary density was unaltered, whereas the density of coronary arteries and especially,arterioles, was significantly increased, as was the number of branches of the main coronary arteries. In addition the coronary flow wassignificantly enhanced in transgenic mice ex vivo. These findings already demonstrated an important role of FGF-1 in the differentiation andgrowth of the coronary system and suggested that it is a key regulatory molecule of the differentiation of the arterial system. Furthermore ithas already been shown that in animals without ischemia endogenous FGF-1 has no angiogenic effect. To test our hypothesis of a non-vascular cardiac protective mechanism of FGF-1 these mice underwent an ischemic period of 15-75minutes or one week. What we found was a markedly delayed infarct development in the transgenic mice with first signs of myocardialinfarction visible at 45 minutes after coronary artery ligation whereas wildtype animals developed myocardial necrosis already after 15minutes of ischemia. Maximal infarct size (60% of risk area) did not differ, but transgenics reached maximal infarction after 75 minutescompared to 45 minutes in wildtype animals. The in vitro study using adult cardiac myocytes confirmed this delay by showing a significantlyattenuated release of creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH). The delay in infarct development is partially due to a constitutive expression of the extracellular signal-regulated kinases ERK-1 and -2,since they are significantly more activated from an already higher basic level in the myocardium of transgenics. Additionally, injection of theERK-1/-2 inhibitor UO126 decreased the cardioprotective effect of FGF-1. In earlier experiments it has already been shown that ERK-1and -2 are one of the major components of ischemic preconditioning. Since an angiogenic/arteriogenic mode of action should have reduced the final infarct size due to enhanced collateral flow (coronarydensity was increased in transgenics), these results imply a non-vascular cardioprotective mechanism. After one week of occlusion we investigated the effects of the constitutive cardiac-specific overexpression on cardiac function andremodeling of the scar tissue and remote myocardium. The cardiac index (CI) decreased in both experimental groups after myocardialinfarction. In FGF/MI animals, both basal CI and CI after volume loading were lower in comparison with wildtype littermates. The capillarydensities did not differ between the wildtype and the transgenic animals. The fact that the cardiac myocytes showed a decrease in densityand increased in size in the transgenic mice after a myocardial infarction indicates an enhanced hypertrophic response of the remotemyocardium. In addition, higher apoptosis rates and lower collagen content were found in the scar tissue of FGF-1 transgenic mice, whileDNA synthesis in the scar tissue was not different. Therefore we conclude that cardiac-specific FGF-1 overexpression inducesdeterioration of cardiac function and an altered cardiac remodeling response following chronic experimental myocardial infarction. In summary we conclude that the constitutive cardiac specific overexpression of FGF-1 induces cardioprotection and improves cell survival,thereby mimicking ischemic preconditioning. But additionally it lowers the functional recovery of the heart after chronic myocardial infarction. In the majority of both, animal and human studies, FGF-1 administration and FGF-2 administration or overexpression were demonstrated tobe beneficial for the heart in situations of acute ischemia. However, until now little is known about the effects of FGF-1 given at the onset ofreperfusion. This would be important to know for treatment of patients suffering from an acute myocardial infarction. If administration ofFGF-1 would also be beneficial after restoration it could e.g. be given together with the thrombolytic therapy, since it has been proven thatnot only ischemia itself but, even more pronounced, the subsequent reperfusion induces damage to the myocardial area at risk. This couldreduce the infarct size and improve cardiac functional recovery. In contrast, the positive effect of endogenous FGF-1 for a patient suffering from an acute myocardial infarction remains questionable.Although our data show a clear delay in infarct size development the outcome after a myocardial infarction seems to be worth regarding thedeterioration in myocardial remodeling and heart functions. Additionally, our transgenic mouse model provides a good tool for studying the underlying mechanisms of FGF-1. Our collaborators inMaastricht and we were already able to show in this transgenic mouse model that the cardioprotective effect of endogenous FGF-1 isneither related to an angiogenic nor an arteriogenic mechanism. In fact the cardioprotective effect is FGF-receptor 1 mediated but incontrast the FGF-1 mediated protection of cell survival is not. Furthermore it revealed that the cardioprotective effect, mimicking ischemicpreconditioning, involves FGF-receptor 1, Protein Kinase C, Tyrosine Kinases and further downstream also the MAPKinases ERK-1 and-2.