Hepatische Arzneistofftransporter der Oatp1b-Subfamilie von Haus- und Nutztieren : Klonierung, Polymorphismenanalyse und funktionelle Charakterisierung

Abstract

Die Organic Anion Transporting Polypeptides (OATPs) stellen beim Menschen eine Familie von Arzneistofftransportern mit insgesamt 11 Mitgliedern dar, die in verschiedenen Organen exprimiert werden und für die Aufnahme von exogenen und endogenen Substanzen in die entsprechenden Zellen verantwortlich sind. Die humanen OATP1B1- und OATP1B3-Transporter befinden sich nahezu ausschließlich in der Leber und vermitteln an der sinusoidalen Membran der Hepatozyten die Aufnahme von z.B. Billirubin, Gallensäuren, konjungierten Steroiden und Schilddrüsenhormonen aber auch von Arzneistoffen wie Statinen, Antibiotika, Zytostatika und ACE-Hemmern. Inzwischen wurden bei OATP1B1 und OATP1B3 zahlreiche Polymorphismen identifiziert, von denen einige auch von klinischer Relevanz sind. So führen bestimmte Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) zu einer verminderten Aufnahme von Statinen in die Hepatozyten, was beim Menschen eine Statin induzierten Myopathie hervorrufen kann.In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal Leberbiopsieproben aus einem größeren Patientenkollekiv von Hunden nach Polymorphismen in dem entsprechenden Transporter des Hundes (cfOatp1b4) hin untersucht. Neben der bereits zuvor beschriebenen cfOatp1b4 cDNA-Sequenz konnte lediglich eine neue polymorphe Variante (693 A>G & 1186 A>G) des cfOatp1b4 isoliert werden. Bei einigen Tieren wurde dieser Haplotyp auch heterozygot nachgewiesen. Damit stellte sich der cfOatp1b4, anders als erwartet, nicht so polymorph dar wie die Lebertransporter OATP1B1 und OATP1B3 des Menschen. Unterschiede in der Expression des cfOatp1b4 in der Leber des Hundes wurden mit der Real-time PCR untersucht. Hierbei zeigten sich kaum Unterschiede zwischen den einzelnen Hunden, ebensowenig zwischen den beiden cfOatp1b4-Varianten, sodass die Expression des cfOatp1b4 als konstant hoch angesehen werden kann und der gefundene polymorphe Haplotyp keine Auswirkung auf die mRNA-Expression des cfOatp1b4 zu haben scheint. Die funktionelle Charakterisierung der gefundenen cfOatp1b4-Varianten stellte sich im Zellkulturmodell trotz verschiedener Versuchsansätze als problematisch dar. Durch Immunfluoreszenz und Western Blot konnte gezeigt werden, dass dies auf eine unzureichende Proteinsyntheserate zurückzuführen ist. Die Ursache hierfür ließ sich in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht klären. Aus diesem Grund wurden als weiteres Expressionsmodell Xenopus laevis Oozyten verwendet. Hierbei zeigten beide cfOatp1b4-Varianten eine Aufnahme von BSP, E1S und TC, wobei die BSP-Aufnahme der polymorphen Variante signifikant höher war, als die des Wildtyps. Für CCK8 konnte lediglich für den Oatp1b4-Wildtyp ein Transport nachgewiesen werden, nicht jedoch für Oatp1b4*. Ebenfalls zeigten beide Oatp1b4-Varianten eine Aufnahme des Herzglykosids Digoxin.Neben den ausführlichen Untersuchungen des caninen Oatp1b4 Transporters erfolgte auch die Erstklonierung der Oatp1b4-Transporter von Katze, Pferd und Schwein. Des Weiteren wurde für den bovinen Oatp1b4 Transporter das Zellkultursystem als weiteres Expressionsmodel zur Untersuchung seiner Funktionalität etabliert. Bei der vergleichenden Darstellung zu den humanen Transportern OATP1B1 und OATP1B3 konnte an ausgewählten Modellsubstraten gezeigt werden, dass der bovine Oatp1b4 Transporteigenschaften beider humaner Transporter vereinigt. The organic anion transporting polypeptides (OATPs) are a family of transporters which mediate the uptake of different kind of substrates into cells. The liver specific transporters OATP1B1 and OATP1B3 mediate the uptake of endogenous substrates like bile acids, thyroid hormones or eicosanoids as well as drugs like antibiotics, anticancer drugs or statins into hepatocytes. Many sequence variants were found in the past especially for OATP1B1. Some of these single nucleotide polymorphisms (SNPs) result in modified transport activity which can be important for medical therapies with some drugs like statins.The aim of this current study was to have a closer look on the canine Oatp1b4 transporter. Many samples of canine liver tissue were collected in cooperation with the veterinarian clinic at Justus-Liebig-University Giessen and were searched for polymorphisms in the sequence of Oatp1b4. Besides the already known variant we could find a polymorphic variant with two SNPs (693 A>G & 1186 A>G). Some of the dogs were heterozygous others were homozygous for this haplotyp. So the canine Oatp1b4 transporter wasn t that polymorphic as it was suspected before. The expression of Oatp1b4-mRNA in liver was measured by real time PCR and showed low variation between the dogs as well as between the two Oatp1b4 variants. So we can state that the SNPs found in canine Oatp1b4 have no effect on the mRNA expression level. Funcional characterization of both canine Oatp1b4 variants was first performed in cell culture. But despite different types of experimental setups no reliable data could be archieved. Western blot analysis and immunofluorescent microscopy revealed low rates of protein synthesis only for the cfOatp1b4, but not for rat Oatp1b2 for unknown reason. So we decided to use Xenopus laevis oocytes as additional expression system. Uptake experiments showed transport of BSP, E1S and TC. The uptake of BSP of the polymorphic cfOatp1b4 variant was significantly higher compared to cfOatp1b4 wildtype. CCK8 was only transported by cfOatp1b4 wildtype but not by the polymorphic variant. Both variants also showed an uptake of digoxin.Furthermore we were the first to clone the Oatp1b4 transporters of cat, horse and pig out of liver tissues and established a cell system as expression model for bovine Oatp1b4. Experiments with bovine Oatp1b4 showed overlapping transport activity with OATP1B1 as well as OATP1B3 while using model substrates for these transporters.