Analyses on Extracellular Trap (ET) formation against relevant coccidean parasites of ruminants

Abstract

Polymorphonuclear neutrophils (PMN) belong to the innate immune system and own different effector mechanisms for invasive pathogen attack. Amongst these, Neutrophil Extracellular Trap (NET) formation is utilized to combat pathogens in the extracellular compartment. In the present dissertation several different parasites, such as the protozoans Besnoitia besnoiti, Eimeria arloingi, Cryptosporidium parvum and Toxoplasma gondii as well as the nematode Haemonchus contortus were investigated for their ability to induce NET formation, and, except for T. gondii, these species were here identified for first time as NET inducers. Quantative analyses demonstrated that coccidia-triggered NETosis is a time- and dose-dependent effector mechanism. Furthermore, this effector mechanism revealed as a parasite- and host species-independent process, since sporozoites of other, mainly non-bovine apicomplexan species (e. g. Isospora suis, Eimeria arloingi) equally induced NETosis in bovine PMN. In line, PMN from different host origin, such as equine, canine and caprine PMN, equally released extracellular traps in response to the strict host-specific parasite E. bovis. In addition, not only sporozoites but also tachyzoites, merozoites and oocysts induced NET formation suggesting a stage-independent mechanism and thereby proposing NET formation as a generally valid effector mechanism against coccidian parasites. To further characterize parasite-triggered NETosis, classical components of NETs, such as histones, neutrophil elastase (NE) and myeloperoxidase (MPO), were detected in NET structures via antibody-based co-localization experiments. In addition, the key role of these enzymes were proven by both, measurements of enzymatic activities and functional inhibition experiments. Regarding second messengers that might be involved in NETs, we analyzed the role of store operated calcium entry (SOCE). Given that chemical blockage of SOCE resulted in a significant reduction of Eimeria-triggered NET formation, parasite-triggered NETosis revealed as a calcium-dependent process. Since SOCE is also involved in the ERK1/2- and p38 MAP kinase-mediated signalling pathways, the role of these enzymes was investigated via western blot analyses revealing enhanced enzyme phosphorylation during E. bovis-induced NETosis. In agreement, chemical inhibition of ERK-MEK- and p38-mediated signal transduction led to reduced NET formation thereby indicating a key role of these signaling pathways for E. bovis-, C. parvum- and T. gondi-induced NETosis. Moreover, PMN-derived CD11b was here demonstrated for the first time to be involved in parasite-triggered NETosis. Thus, a significant upregulation of CD11b surface expression was detected upon PMN exposure to E. bovis sporozoites. In addition, antibody-mediated blockage of CD11b led to a significant decrease of sporozoite-triggered NET formation.Scanning electron microscopic (SEM) analyses and parasite-entrapment assays highlighted the significant capability of NETs to entrap all parasite stages studied in the current dissertation. In accordance, host cell invasion assays confirmed that NET-triggered extracellular arrest of coccidian parasites effectively hampered these from active host cell invasion, as demonstrated for E. arloingi-, C. parvum- and B. besnoiti-stages. In addition, in vivo presence of NETs was here demonstrated via immunohistological analyses showing for the first time NET structures being in direct contact or close proximity to different Eimeria stages in intestinal tissue samples of E. bovis- and E. arloingi-infected animals.Furthermore, other innate immune cells than PMN, such as monocytes and eosinophils, were here also proven to trigger ETs in response to parasitic stages. As an important finding, the formation of different morphological forms of NETs, such as diffuse , spread and aggregated NETs in response to nematode (H. contortus) larvae were here reported. Overall and based on the current data, NETosis may significantly alter the outcome of coccidian infections via hampering parasitic stages from invading new host cells and thereby from proliferation in vivo. Die zum angeborenen Immunsystem gehörenden neutrophilen Granulozyten (PMN) verfügen über verschiedenen Effektormechanismen zur Bekämpfung invasiver Pathogene. Darunter fällt der erst seit 2004 bekannte Mechanismus der Neutrophil Extracellular Trap (NET)-Bildung, der zur Attacke gegen Pathogene im extrazellulären Kompartiment genutzt wird. In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Parasitenarten, wie die Protozoen Besnoitia besnoiti, Eimeria arloingi, Cryptosporidium parvum, Toxoplasma gondii sowie Stadien des Nematoden Haemonchus contortus, auf ihre Befähigung zur NET-Auslösung untersucht. Mit Ausnahme von T. gondii wurden die genannten Arten hier erstmalig als NET-Induktoren identifiziert. Über quantitative Analysen konnte gezeigt werden, dass die durch Apikomplexa ausgelöste NETose ein zeit- und dosisabhängiger Effektormechanismus ist. Des Weiteren zeigte sich, dass diese Abwehrreaktion weder einen parasitenspezifischen noch einen wirtsspezifischen Prozess darstellt, da Sporozoiten anderer verwandter, nicht-boviner Kokzidienarten (z. B. Eimeria arloingi, Isospora suis) gleichermaßen NETose bei bovinen PMN induzierten. Gleichfalls reagierten PMN anderer Spezies, wie Pferd, Hund und Ziege, mit einer NET-Freisetzung gegen den streng wirtspezifischen Parasiten E. bovis. Darüber hinaus induzierten nicht nur Sporozoiten-Stadien, sondern auch Tachyzoiten, Merozoiten und Oozysten die NET-Bildung, was auf einen stadienunabhängigen Mechanismus hindeutet. Somit scheint die NET-Bildung ein allgemein gültiger Effektormechanismus gegen Kokzidien zu sein. Zur Charakterisierung der NETs wurden klassische Komponenten wie Histone, Neutrophile Elastase (NE) und Myeloperoxidase (MPO) mittels antikörperbasierter Untersuchungsverfahren in Ko-Lokalisierungsstudien zu NET-Strukturen nachgewiesen. Weiterführende Messungen von Enzymaktivitäten als auch funktionelle Inhibitionsexperimente bestätigten, dass NADPH-Oxidase, NE und MPO Schlüsselenzyme der über Kokzidien ausgelösten NETose sind. In Bezug auf sekundäre Botenstoffe, die an der NET-Bildung beteiligt sein könnten, konzentrierten sich die Untersuchungen auf den sog. store operated calcium entry (SOCE). Die Verwendung spezifischer SOCE-Inhibitoren führte zu einer signifikanten Verringerung der parasiteninduzierten (E. bovis, T. gondii and C. parvum) NET-Bildung, was einen Kalzium-abhängigen Prozess nahelegt. Da SOCE zudem in den über ERK1/2- und p38 MAP Kinase-vermittelten Signalweg involviert ist, wurde auch die Rolle dieser Enzyme überprüft und gezeigt, dass sie bei der E. bovis-induzierten NETose vermehrt phosphoryliert werden. Auch eine chemische Blockade der ERK-MEK- und p38-vermittelten Signalwege bestätigte die Schlüsselrolle dieser Enzyme bei der E. bovis-, C. parvum- und T. gondi-induzierten NETose. Neben Signalwegen wurde hier zudem erstmalig gezeigt, dass der PMN-assoziierte Rezeptor CD11b an der parasiteninduzierten NETose beteiligt ist. Entsprechend wurde eine signifikante Hochregulation der Oberflächenexpression dieses Rezeptors bei PMN in Reaktion auf E. bovis-Sporozoiten nachgewiesen. In Übereinstimmung führte eine Antikörper-vermittelte Blockade des CD11b zu einer signifikanten Abnahme der Sporozoiten-induzierten NET-Bildung.Sowohl Scanning-elektronenmikroskopische Untersuchungen als auch Experimente zum Abfangen von Parasitenstadien zeigten die signifikante Fähigkeit von NETs, die untersuchten Parasitenstadien zu immobilisieren. Dementsprechend bestätigten Wirtszellinvasionstests, dass die extrazelluläre, NET-basierte Attacke zu einer wirksamen Verhinderung der aktiven Parasiteninvasion in Wirtszellen führt, wie für E. arloingi-, C. parvum- und B. besnoiti-Stadien nachgewiesen. Zusätzlich konnte hier auch unter Bearbeitung ex vivo gewonnener histologischer Präparate die in vivo-Relevanz von NETs über deren Nachweis in Darmpräparaten Eimeria-infizierter Tiere bestätigt werden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Extracellular Traps (ETs) nicht nur von PMN, sondern auch von anderen Immunzellen wie Monozyten und Eosinophile als Effektormechanismus gegen Parasitenstadien gebildet werden. Ein wichtiger Befund war zudem, dass Nematoden (H. contortus)-Larven verschiedene morphologische Erscheinungsformen der NETose wie diffuse , spread und aggregated NETs bei PMN induzieren. Zusammenfassend wird hier postuliert, dass die effiziente NETose den Ausgang parasitärer Infektionen signifikant beeinflussen kann, indem obligat intrazelluläre Parasitenstadien daran gehindert werden, in geeignete Wirtszellen in vivo einzudringen.