Das Virus der porzinen epidemischen Diarrhö : Charakterisierung mittels reverser Genetik

Abstract

Die porzine epidemische Diarrhö (PED) ist eine weltweit auftretende, wirtschaftlich bedeutsame Erkrankung des Schweines und wird durch das Virus der porzinen epidemischen Diarrhö (PEDV) verursacht. Das Auftreten hochvirulenter Stämme in Asien und den USA mit Mortalitätsraten um 100 % bei Saugferkeln hat in den letzten Jahren zu großen ökonomischen Verlusten in Schweinebetrieben geführt. Um eine Differenzierung dieser hochvirulenten von klassischen oder schwachvirulenten Stämmen zu ermöglichen und effiziente Vakzinen herstellen zu können, ist die Identifizierung von Virulenzfaktoren und biologischer Marker der unterschiedlichen Varianten notwendig. Zu diesem Zweck wurde im Rahmen dieser Arbeit ein revers-genetisches System für ein hochvirulentes US-Feldisolat etabliert. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Zur Herstellung eines infektiösen Klons wurde das komplette Genom von PEDV Minnesota (MN), basierend auf der Datenbanksequenz, in überlappenden cDNA-Fragmenten synthetisiert und in das Vacciniavirusgenom als Vektor eingeführt. 2) Die Generierung rekombinanter Viren auf Basis der kompletten PEDV-MN-Datenbanksequenz war nicht erfolgreich. Durch Mutationen in der 5 UTR und dem S-Gen konnten essentielle Nukleotide bzw. Aminosäuren im PEDV-MN-Genom identifiziert werden, die einen erfolgreichen Rescue und In-vitro-Kultivierung ermöglichten. Somit wurde ein geeignetes System zur Herstellung rekombinanter PEDVs etabliert.3) Durch Infektion von neugeborenen Ferkeln wurde anschließend evaluiert, ob das, ausgehend vom cDNA-Klon hergestellte, recPEDV-MN in der Lage war, PED auszulösen. Außerdem wurde der Einfluss des S-Proteins auf die Virulenz in vivo untersucht. Dazu wurden Ferkel mit einem recPEDV-MN, bei dem SMN durch das S-Gen des zellkulturadaptierten Stammes CV777 ersetzt worden war, infiziert. 4) In einem weiteren Tierversuch wurde die Rolle von ORF3 in der Virulenz von PEDV untersucht. Zu diesem Zweck erhielten SPF-Ferkel recPEDV-MN mit einer Deletion in ORF3, die in einem trunkierten Genprodukt resultiert, als Inokulum.Die Ergebnisse der Tierversuche zeigten, dass recPEDV-MN mit Modifikationen in der 5 UTR und dem S-Gen in der Lage war, PED mit schweren klinischen Symptomen auszulösen. Weiterhin resultierte der Austausch von SMN durch SCV777 in einer Attenuierung von recPEDV. Die Zerstörung von ORF3 führte dagegen nicht zu einer Attenuierung von recPEDV. Daher spielt Gen 3 keine Rolle für die Virulenz in vivo.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das im Rahmen dieser Arbeit etablierte revers-genetische System erfolgreich zur Identifizierung von Virulenzfaktoren von PEDV eingesetzt werden kann. Porcine epidemic diarrhea (PED) represents an economically important disease of swine worldwide, and is caused by the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). The emergence of highly virulent strains in Asia and the USA, inducing severe disease in newborn piglets with mortality rates up to 100%, caused high economic losses fort he swine industry. In ordert o differentiate between these high-pathogenic and classical or low-pathogenic strains and to generate effective vaccines, identification of biological markers and virulence factors is necessary. To this end, a vaccinia virus-based reverse genetic system for a highly virulent US field isolate was established in this study. The following results were obtained:Fort he generation of an infectious clone, the entire genome of PEDV Minnesota (MN), based on the databank sequence, was synthesized as overlapping cDNA fragments and introduced into vaccinia virus genome, which serves as a vector.2) First experiments showed that the infectious clone based on the original databank sequence did not allow the rescue of PEDVs. Mutations in 5 UTR and S gene enabled the identification of nucleotides/amino acids in the PEDV genome, which were essential for successful rescue and in-vitro-cultivation. Thus, a suitable reverse genetic system to generate recPEDVs was established.3) In ordert o investigate whether the recombinant PEDV MN based on the cDNA clone was able to induce PED, newborn piglets were infected. To elucidate the role of the S protein in PEDV virulence, piglets were inoculated with another recPEDV-MN, in which SMN was replaced by the S gene of the cell culture adapted strain CV777. 4) A second animal experiment was performed to investigate the role of ORF3 in PEDV virulence. For this purpose, piglets were infected with recPEDV-MN containing a deletion in ORF3, which leads to a truncated gene product. The results of the animal experiments showed that recPEDV-MN with modifications in 5 UTR and S gene was able to induce a severe form of PED. Furthermore, substitution of SMN by SCV777 attenuated recPEDV in vivo. In contrast, deletion in ORF3 did not lead to attenuation of the virus, suggesting that gene 3 has no impact on PEDV virulence in vivo. In summary, these findings demonstrate that the reverse genetic system established in this study can successfully be used to identify virulence factors of PEDV.