Untersuchungen zu Angiostrongylus vasorum und anderen Lungenwürmern von Hund und Katze im Zwischenwirt Nacktschnecke

Abstract

Über Gastropoden vermittelte Lungenwurminfektionen spielen zunehmend eine Rolle in deutschen Katzen- und Hundepopulationen. Da zur aktuellen Situation in gastropoden Zwischenwirten von Lungenwurminfektionen bisher keinerlei Daten vorlagen, wurde hier erstmalig eine ganzjährige, epidemiologische Studie in ausgewählten Regionen Deutschlands durchgeführt, die die Prävalenzen von klassischen Lungenwürmern der Karnivoren wie Angiostrongylus vasorum, Crenosoma vulpis und Aelurostrongylus abstrusus in natürlichen Nacktschneckenpopulationen erfassen sollte. Über die Untersuchung von insgesamt 2701 Nacktschnecken aus Hessen und Rheinland-Pfalz konnte gezeigt werden, dass Infektionen mit A. vasorum, C. vulpis und A. abstrusus in unterschiedlichen Häufigkeiten in der Zwischenwirtspopulation nachweisbar sind. Im Falle von A. vasorum wurden gebietsweise und jahreszeitlich stark schwankende Prävalenzen (1-19,4 %) gemessen, die dem typischen fleckenhaften geographischen Verteilungsmuster des Parasiten entsprechen. Die Gesamtprävalenz von A. vasorum betrug 4,7 %. C. vulpis war in 2,3 % der Nacktschnecken zu finden, A. abstrusus in 0,2 % der Zwischenwirte. Da zu allen Jahreszeiten Lungenwurm-infizierte Schnecken gefunden wurden, ist davon auszugehen, dass für Hunde, die in Endemiegebieten leben, das ganze Jahr über ein Infektionsrisiko besteht. Dennoch konnte anhand von statistischen Analysen belegt werden, dass das höchste Infektionsrisiko für Hunde bezogen auf A. vasorum- und C. vulpis-Infektionen im Herbst vorliegt. Bezogen auf die jeweiligen Zwischenwirte belegen die Daten artspezifische Effekte, da Arion lusitanicus höhere A. vasorum-Prävalenzen als Deroceras reticulatum und D. reticulatum höhere Larvenbürden als A. lusitanicus aufwiesen.Da bisher nur sehr wenig zu Abwehrreaktionen der Zwischenwirte auf Lungenwurminfektionen bekannt ist, wurden zudem Immunreaktionen experimentell infizierter Nacktschneckenspezies untersucht. Dazu wurden zunächst Protokolle sowohl zur standardisierter Haltung und Kultur unterschiedlicher Schneckengenera (Arion, Deroceras, Limax, Achatina) als auch zur Gewinnung vitaler Hämozyten als Abwehrzellen von Schnecken und axenischer Lungenwurmlarven etabliert.Über die in vitro-Exposition von Hämozyten unterschiedlicher Gastropodenarten mit Larven unterschiedlicher Lungenwurmspezies konnte hier erstmalig gezeigt werden, dass Hämozyten von Schnecken in der Lage sind, sog. Extracellular Traps (ETs) in Reaktion auf Nematodenlarven zu bilden und über diese die Pathogene zu immobilisieren. Zudem wurde belegt, dass an dieser nicht-adaptiven Immunreaktion zum Vertebratensystem ähnliche Moleküle wie Myeloperoxidase, Elastase und Histone sowie extrazelluläres Chromatin beteiligt sind. In Analogie zum Vertebratensystem konnte außerdem gezeigt werden, dass auch bei Gastropoden morphologisch unterschiedliche Typen von ETs gebildet werden, nämlich aggregated, diffuse und spread ETs. Durch die Verwendung verschiedener Schnecken- und Lungenwurmarten wurde zudem belegt, dass die ETose unabhängig von der Wirts- und Parasitenart stattfindet. Da unterschiedliche Larvenstadien gleichermaßen ETose auslösten, war dieser Prozess zudem als stadienunabhängig zu bewerten. Die Analyse rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen nach experimentellen Lungenwurminfektionen von Nacktschnecken ermöglichte schließlich den in vivo-Nachweis der ETose, da ETs in Reaktion auf eindringende Lungenwurmlarven auf der Körperoberfläche der Gastropoden dargestellt werden konnten. Insgesamt wurde die Hämozyten-vermittelte ETose terrestrischer Gastropoden als ein schnell (bereits 10 Minuten nach der Konfrontation erfolgend) und effizient (fast die Hälfte aller Larven wurde durch ETs gefangen) ablaufender Effektormechanismus identifiziert. Gastropod-borne lungworm infections of dogs and cats are of increasing concern for veterinarians in Europe. Since data on lungworm infections in German gastropods were lacking, we here conducted an epidemiological survey on gastropod lungworm infections spanning an entire year in selected regions of Germany. The aim was to determine the actual prevalence of classical gastropod-borne canine and feline lungworms, such as Angiostrongylus vasorum, Crenosoma vulpis and Aelurostrongylus abstrusus. By analysing 2701 slugs from Hesse and Rhineland-Palatine, the presence of A. vasorum, C. vulpis and A. abstrusus larvae in gastropod intermediate hosts at varying prevalences was proven. The overall prevalence of A. vasorum, C. vulpis and A. abstrusus in slugs was 4.7 %, 2.3 % and 0.2 %, respectively. Overall, A. vasorum prevalences varied strongly (1 % - 19.4 %) in a season- and region-dependent manner thereby corresponding to the well-known patchy geographic distribution of this parasite. Given that slugs proved infected all over the year, dogs are at permanent risk of A. vasorum-infections when living in endemic areas. Nevertheless, autumn revealed as the season with the highest infection risk for canine A. vasorum and C. vulpis infections. Regarding intermediate host susceptability, the current data confirmed species-specific effects, since Arion lusitanicus was significantly more often infected with A. vasorum than Deroceras reticulatum and D. reticulatum slugs showed higher larval burdens than Arion specimen. Overall, this survey contributed to a better understanding of seasonal fluctuations in lungworm prevalences and revealed slug species-associated risk factors for canine Angiostrongylosis. By confronting gastropod haemocyte with larval lungworm stages in vitro, first-ever evidence on gastropod haemocyte-triggered ET formation was given. This defence mechanism led to effective pathogen immobilisation but failed to trigger lethal effects. Moreover, molecules similar to the vertebrate system, such as myeloperoxidase, elastase and histones as well as extracellular chromatin were proven as classical components of this non-adaptive immune mechanism in slugs. In line with findings in the vertebrate system, differend types of ETs, such as aggregated, diffuse and spread ETs were detected in the gastropod system. Furthermore, gastropod ETosis was proven as host species-independent since several slug species formed ETs in a comparable manner in reaction to lungworm larvae. Given that ETs were equally formed in reaction to three different lungworm species (A. vasorum, C. vulpis and A. abstrusus) and to two different larval stages (L1, L3), this innate immune mechanism additionally revealed as a parasite species- and parasitic stage-independent process. Finally, scanning electron microscopy-based visualization of ET formation on the body surface of slugs in reaction to skin penetrating lungworm larvae proved the in vivo existence of this effector mechanism. Overall, gastropod-derived ETosis revealed as a fast (10 minutes after confrontation with larvae) and efficient effector mechanism of haemocytes (almost half of all larvae used were entrapped by ETs).