Characterization of a Pseudorabies virus mutant lacking the pUS3 kinase and the tegument protein pUL21 in vitro and in vivo and the evaluation of an improved animal model for human Herpes Simplex Encephalitis

Abstract

Alphaherpesviruses are neuroinvasive viruses with the ability to cause severe diseases in humans and animals. HSV-1 is a human pathogen known to sporadically induce fronto-temporal meningoencephalitis, which is associated with high mortality rates and long lasting sequelae such as chronic or relapsing inflammation, cognitive alterations or epilepsy. PrV is an animal pathogen causing CNS disorders primarily in piglets. In non-porcine species PrV infection leads to severe itching followed by automutilation and death of the infected and diseased animal. After primary replication in epithelial cells, HSV-1 and PrV infect sensory neurons in which they are transported to peripheral ganglia and towards the CNS. In the past, the function of different PrV proteins for neuroinvasion has been studied in mice using corresponding viral gene deletion mutants. These studies revealed that infection with a PrV mutant lacking the tegument protein pUL21 and the pUS3 kinase led not only to a significantly prolonged survival time but unlike to infection with PrV wildtype or other mutants, which was always fatal, most mice survived the infection.In this thesis, this phenotype was studied in detail. To test whether the effect resulted from the absence of the pUS3 kinase function of or from the absence as virion structural component, virus mutants PrV-US3deltakin and PrV-deltaUL21/US3deltakin were constructed and compared to PrV- deltaUS3 and PrV-deltaUL21/US3. In addition to the influence of the kinase-active pUS3, the function of the two described isoforms, pUS3- S and pUS3-L, was analyzed. In vitro data showed that while pUS3-L plays no major role in the viral replication cycle, the abundant, catalytically active short isoform of pUS3 is required for efficient nuclear egress and production of infectious progeny. However, the accumulations of primary virions in huge herniations of the INM described for mutants lacking US3 are not the cause for the observed drop in virus titers. PrV-deltaUS3, lacking the open reading frame completely, or PrV-US3deltakin, carrying only a single nucleotide exchange resulting in inactivation of the kinase activity, showed comparable phenotypes not only in cell culture but also in the mouse indicating that the enzymatic function but not pUS3 as structural virion component are important. Corresponding phenotypes in cell culture and for survival times in mice were also evident for the mutants lacking in addition UL21 (PrV-deltaUL21/deltaUS3, PrV- deltaUL21/US3deltakin). Based on these data, PrV-deltaUL21/US3deltakin was used to analyze the pathobiological mechanism in comparison to PrV-Kaplan and the corresponding single mutants (PrV- US3deltakin, PrV-deltaUL21) in mice. As reported before for PrV-deltaUL21/US3 (Maresch 2011), and in contrast to mice infected with wildtype PrV or the single mutants, nearly all PrV-deltaUL21/US3deltakin infected animals survived.In an extended experiment, mice infected with PrV-deltaUL21/US3deltakin and the control viruses were euthanized and thoroughly studied at different time points after infection. Viral spread and inflammatory response were assessed histologically and correlated to the clinical status. Besides a slight delay in the onset of clinical signs and neuroinvasion in PrV-US3deltakin infected mice, no difference to mice infected with PrV- Kaplan was evident indicating that the pUS3 kinase obviously has no role in neuroinvasion or pathogenicity. PrV-Kaplan and PrV-US3deltakin showed fast neuronal spread and occasionally induced only very mild inflammatory reaction, which might be due to the short time between infection and death of the animals. Infection with PrV- deltaUL21 resulted in delayed, but more widespread neuroinvasion and pronounced inflammation in the ganglia and mild inflammatory response in the brainstem, which correlates with the extended survival time. However, all mice infected with PrV-deltaUL21 developed severe clinical signs and had to be euthanized. PrV-deltaUL21/US3deltakin spread even slower than PrV-deltaUL21, but invaded the cerebral cortex, mainly the frontal and temporal lobe starting 8 d p.i. A fulminant lymphohistiocytic reaction developed, which was first detected in the ganglia and brainstem, but was more pronounced in the telencephalon affecting the temporal and frontal lobe starting 9 d p.i. With increasing inflammation, also behavioral abnormalities occurred in mice, which culminated between 9 to 14 d p.i., whereas mild pruritus and skin lesions developed after 6 d p.i. While viral antigen was no longer detectable in mice sacrificed later than 15 d p.i., meningoencephalitis was present in mice examined at the end of the experiment at day 21 p.i. Despite widespread neuroinvasion and concomitant meningoencephalitis mice were able to survive an infection with PrV deltaUL21/US3deltakin, which had not been reported for any other PrV mutant.Although the mode of interplay between pUL21 and the kinase activity of pUS3 remained enigmatic, the most important result of this study is that PrV-deltaUL21/US3deltakin infected mice showed unexpected but striking analogies to human HSE including fronto-temporal, lesion-associated virus tropism combined with behavioral abnormalities, which in combination could not be achieved in other animal models. Furthermore, skin lesions and the presence of myelitis in PrV-deltaUL21/US3deltakin infected mice partially resembled the disease caused by VZV in humans.With PrV-deltaUL21/US3deltakin infection in mice as model, detailed investigations on herpesvirus neuroinvasion, neuronal spread, and immune reaction in the brain but also advanced neuronal tracing is possible that will significantly contribute to our understanding not only of herpesvirus pathobiology but also of neuroanatomical networks. Alphaherpesviren sind neuroinvasive Viren, die schwerwiegende Erkrankungen bei Menschen und Tieren auslösen können. Das humanpathogene HSV-1 führt in sporadischen Fällen zu einer fronto-temporalen Meningoenzephalitis, die mit einer hohen Mortalitätsrate und mit schwerwiegenden Langzeitfolgen wie chronischer oder rezidivierender Entzündung, kognitiver Beeinträchtigung oder Epilepsie assoziiert ist. PrV ist ein porzines Herpesvirus, das vorwiegend bei Ferkeln zu zentralnervösen Symptomen führt. In nicht-porzinen Spezies führt die PrV-Infektion zu schwerwiegendem Juckreiz, zu Automutilation und letztendlich zum Tod des infizierten und erkrankten Tieres. HSV-1 und PrV infizieren nach der primären Replikation in Epithelzellen sensorische Nervenzellen, in welchen sie über periphere Ganglien zum ZNS transportiert werden. In der Vergangenheit konnte die Funktion von verschiedenen PrV Proteinen für die Neuroinvasion bei Mäusen mit Hilfe von viralen Gendeletionsmutanten untersucht werden. Diese Studien zeigten, dass eine Infektion mit der PrV-Doppelmutante PrV-deltaUL21/US3, nicht nur in einer signifikant verlängerten Überlebenszeit resultierte, sondern dass im Gegensatz zur tödlichen Infektion mit dem Wildtyp oder anderen Mutanten, die meisten Mäuse überlebten.In der vorliegenden Dissertation wurde dieser Phänotyp weitergehend untersucht. Um zu testen, ob die Eigenschaft auf die fehlende Kinasefunktion oder das Fehlen des pUS3 als Virion-Strukturkomponente zurückzuführen ist, wurden die Virusmutanten PrV-US3deltakin und PrV-deltaUL21/US3deltakin, bei denen nur die Enzymaktivität durch eine Punktmutation inaktiviert wurde, das Protein aber weiterhin exprimiert wird, generiert und mit den US3-Deletionsmutanten PrV-deltaUS3 und PrV-deltaUL21/deltaUS3 verglichen. Neben dem Einfluss der Kinaseaktivität wurde zusätzlich die Funktion der beiden beschriebenen unterschiedlich langen Isoformen, pUS3-S (short) und pUS3-L (long), getestet. Die In-vitro-Untersuchungen zeigten, dass pUS3-L keine wesentliche Rolle im viralen Replikationszyklus spielt, jedoch eine genügende Menge des katalytisch- aktiven pUS3-S für einen effizienten Austritt der Nukleokapside aus dem Kern und für die Produktion infektiöser Virusnachkommen vorhanden sein muss. Die großen Akkumulationen von primären Virionen in Hernien der inneren Kernmembran, die für pUS3-Mutanten typisch sind, sind jedoch nicht der Grund für den beobachteten Abfall des Virustiters. Die Mutante PrV-deltaUS3, der der offene Leserahmen vollständig fehlt und die Mutante PrV-US3deltakin mit inaktivierter Kinaseaktivität, zeigten nicht nur in der Zellkultur vergleichbare Phänotypen, sondern auch in der Maus. Dies deutet darauf hin, dass die enzymatische Aktivität die entscheidende Rolle für den Phänotyp spielt. Entsprechende Ergebnisse zeigten sich auch beim Vergleich der Mutanten, denen zusätzlich UL21 fehlte (PrV-deltaUL21/deltaUS3, PrV-deltaUL21/US3deltakin). Basierend auf diesen Daten wurde PrV-deltaUL21/US3deltakin genutzt, um den pathobiologischen Mechanismus im Vergleich zu PrV-Kaplan und den entsprechenden Einzelmutanten (PrV-US3deltakin, PrV-deltaUL21) bei Mäusen zu testen. Wie zuvor für PrV-deltaUL21/US3deltakin (Maresch, 2011) gezeigt, jedoch im Gegensatz zu Mäusen, die mit PrV-Wildtyp oder den Einzelmutanten infiziert waren, überlebten fast alle PrV-deltaUL21/US3deltakin infizierten Tiere.In einem umfassenden Experiment wurden die mit PrV-deltaUL21/US3deltakin und den Kontrollviren infizierten Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion euthanasiert und untersucht. Die Ausbreitung der Viren und die Entzündungsreaktion wurden histologisch beurteilt und mit dem klinischen Status der Tiere korreliert. Abgesehen von einer leichten Verzögerung des Auftretens klinischer Erscheinungen und der Neuroinvasion bei den mit PrV-US3deltakin infizierten Mäusen war kein Unterschied im Vergleich zu PrV-Kaplan erkennbar. Dies weist daraufhin, dass die pUS3-Kinase offensichtlich keine Rolle bei der Neuroinvasion oder für die Pathogenität in diesem System spielt. PrV-Kaplan und PrV-US3deltakin zeigten eine schnelle neuronale Ausbreitung und induzierten in wenigen Tieren eine nur sehr milde Entzündungsreaktion, was auf die kurze Zeit zwischen der Infektion und dem Tod der Tiere zurückzuführen ist. Eine Infektion mit PrV-deltaUL21 führte zu einer deutlich verzögerten, aber ausgedehnteren Neuroinvasion und zu einer ausgeprägten Entzündung der Ganglien sowie einer leichten Entzündungsreaktion im Hirnstamm, was möglicherweise auf die verlängerte Überlebenszeit der Tiere zurückzuführen ist. Alle mit PrV-deltaUL21 infizierten Mäuse entwickelten jedoch schwere klinische Symptome und mussten euthanasiert werden. PrV-deltaUL21/US3deltakin breitete sich noch langsamer als PrV-deltaUL21 aus, drang jedoch ab 8 d p.i. in die Großhirnrinde, hauptsächlich in den Frontal- und Temporallappen, vor. Es entwickelte sich eine fulminante lymphohistiozytäre Entzündungsreaktion, die zuerst in den Ganglien und im Hirnstamm festgestellt wurde, die jedoch im Telenzephalon, besonders im temporalen und frontalen Lappen ab 9 d p.i. deutlicher wurde. Mit zunehmender Entzündung traten auch Verhaltensstörungen bei den Tieren auf, die zwischen 9 und 14 d p.i. ihren Höhepunkt erreichten, während leichter Juckreiz und Hautläsionen schon nach 6 d p.i. beobachtet wurden. Obwohl virales Antigen bei Mäusen, die nach Tag 15 getötet wurden, nicht mehr nachweisbar war, konnte eine Meningoenzephalitis auch bei Tieren nachgewiesen werden, die am Ende des Experiments (Tag 21) getötet wurden. Trotz dieser starken Neuroinvasion und der damit einhergehenden Meningoenzephalitis überlebten die Mäuse eine Infektion. Dies wurde bisher für keine andere PrV-Mutante berichtet.Obwohl die Art des Zusammenspiels zwischen pUL21 und der Kinaseaktivität von pUS3 unklar blieb, ist das herausragende Ergebnis dieser Studie, dass mit PrV-deltaUL21/US3deltakin infizierte Mäuse unerwartete, aber sehr auffällige Analogien zur HSE im Menschen zeigten. Dazu gehörte der fronto-temporale, läsionsassoziierte Virustropismus, der in Kombination mit den beobachteten Verhaltensstörungen so in anderen Tiermodellen bisher nicht reproduziert werden konnte. Ferner ähnelten die Hautläsionen und das Vorhandensein einer Myelitis bei mit PrV-deltaUL21/US3deltakin infizierten Mäusen VZV-induzierten Krankheitsbildern beim Menschen.Mit dem Modell der PrV-deltaUL21/US3deltakin-Infektion von Mäusen sind detaillierte Untersuchungen zur herpesviralen Neuroinvasion, zur neuronalen Ausbreitung und zur Immunreaktion im Gehirn sowie innovatives neuronales Tracing möglich, die nicht nur zum Verständnis von herpesviraler Pathobiologie, sondern auch zur Aufklärung neuroanatomischer Netzwerke beitragen könnten.