Non-suppurative encephalitis and encephalopathies of unknown origin in horses from Brazil

Abstract

Worldwide reports on clinical disease and serological surveys from horses with encephalitis and encephalopathies reveal the increase in emergent, re-emergent, and neglected diseases, mostly due to an infectious agent. Diseases caused by arboviruses or by henipaviruses are known zoonoses, while equine herpesvirus 1 (EHV-1) or protozoal encephalitis are detrimental to animal s performance. However, while most of diagnostics tools are adjusted to fresh tissues, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are vastly used in pathology. Therefore, this study used FFPE tissue from the central nervous system (CNS) of 35 horses from Brazil suffering from non-suppurative encephalitis or encephalopathies as study model. The main aim was to provide adequate diagnostic tools adopted to FFPE tissues for morphologic, antigenic, and molecular detection as well as metagenomic screening of relevant pathogens. Samples available for the study consisted of a mixed population of male and female animals, mostly > 4 years-old, predominantly of mixed breeds. Most of the clinical signs (21/35) pointed to a multifocal distribution of lesions in the CNS, and most cases (20/35) occurred in fall. Histologically, 28/35 cases had inflammation in at least one CNS region or ganglion, and 7/35 had degenerative lesions. Score systems established to assess the degree of inflammatory cell infiltration and glial reaction patterns, revealed the predominance of mild lymphocytic inflammation, and 3 statistically distinguishable grades of astrocytic and microglial activation throughout the cohort. In 20/35 cases, an infectious agent could be related to disease - rabies virus/coccidia coinfection (1/35), alphavirus (6/35), flavivirus (4/35), alphavirus/EHV-1 coinfection (3/35), coccidia (5/35) detection, and helminth larvae migration (1/35). For other 15/35 cases, an unknown infectious etiology was suggested, or degenerative lesions could have mimicked an infection. Concurrently, 4/35 cases were also considered pathogen carriers of Babesia sp. or Elizabethkingia anopheles. The long-term stored FFPE materials used in this study provided valuable epidemiological information and identification of pathogens important for animal and human health. Missing CNS regions, environmental contamination, and protein cross-links bound during fixation might have hindered pathogen identification. In this regard, optimization of techniques such as multiplex sequencing assays using target enrichment could further improve the sensitivity of pathogen detection and decrease host/environment background. Moreover, the methods optimized in this study enable zoonotic pathogen assessment in humans and can also be transferred to important livestock species, like ruminants and pigs, which share susceptibility to several infectious and zoonotic agents. It is expected that during an outbreak e.g., basic laboratories located near affected areas will be able to provide an etiology using the methods quickly and precisely, with the routine procedures of tissue fixation. Weltweite Berichte über klinische Krankheiten und serologische Untersuchungen von Pferden mit Enzephalitis und Enzephalopathien zeigen den Anstieg der auftretenden, wiederauftauchenden und vernachlässigten Krankheiten, meist aufgrund eines infektiösen Erregers. Krankheiten, die durch Arboviren oder durch Henipaviren verursacht werden, sind bekannte Zoonosen, während das Pferdeherpesvirus 1 (EHV-1) oder die Protozoen Enzephalitis die Leistung des Tieres beeinträchtigen. Während jedoch die meisten Diagnosewerkzeuge an frisches Gewebe angepasst sind, wird Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes (FFPE)- Gewebe in den Pathologieeinrichtungen in großem Umfang eingesetzt. Daher verwendete diese Studie FFPE-Gewebe aus dem Zentralnervensystem (ZNS) von 35 Pferden aus Brasilien, die an nicht-suppurativen Enzephalitis oder Enzephalopathien leiden, als Studienmodell. Das Hauptziel bestand darin, geeignete diagnostische Instrumente für FFPE-Gewebe für den morphologischen, Antigen- und molekularen Nachweis sowie metagenomisches Screening relevanter Krankheitserreger bereitzustellen. Die für die Studie verfügbaren Proben bestanden aus einer gemischten Population von männlichen und weiblichen Tieren, die meisten > 4 Jahre alt, überwiegend von gemischten Rassen. Die meisten klinischen Anzeichen (21/35) deuteten auf eine multifokale Verteilung von Läsionen im ZNS hin, und die meisten Fälle (20/35) traten im Herbst auf. Histologisch hatten 28/35 Fälle Entzündungen in mindestens einer ZNS-Region oder einem Ganglion, und 7/35 hatten degenerative Läsionen. Score-Systeme zur Beurteilung des Grades der entzündlichen Zellinfiltration (DICI) und gliale Reaktionsmuster zeigten die Dominanz einer geringgradigen lymphatischen Entzündung und 3 statistisch unterscheidbare Grade der Astrozyten- und Mikrogliaaktivierung in der gesamten Kohorte. In 20/35 Fällen konnten Infektionserreger nachgewiesen werden: Tollwutvirus/Kokzidien-Koinfektion (1/35), Alphavirus (6/35), Flavivirus (4/35), Alphavirus/EHV-1-Koinfektion (3/35), Kokzidien (5/35) und Helminth larvae migrans (1/35). In anderen 15/35 Fällen wurde eine unbekannte infektiöse Ätiologie vorgeschlagen, oder degenerative Läsionen hätten eine Infektion imitieren können. Gleichzeitig wurden 4/35 Fälle auch als Pathogenträger von Babesia sp. oder Elizabethkingia anopheles betrachtet. Die in dieser Studie verwendeten langzeitgelagerten FFPE-Materialien lieferten wertvolle epidemiologische Informationen und die Identifizierung von Krankheitserregern, die für die Gesundheit von Menschen und Tier wichtig sind. Fehlende ZNS-Regionen, Umweltkontaminanten und Protein-cross links, die während der Fixierung gebunden sind, könnten die Identifizierung von Krankheitserregern verhindert haben. In diesem Zusammenhang könnte die Optimierung von Techniken wie Multiplex-Sequenzierungsassays mittels Target enrichment die Empfindlichkeit des Pathogennachweises weiter verbessern und gleichzeitig den Host-/Umgebungshintergrund verringern. Darüber hinaus ermöglichen die in dieser Studie optimierten Methoden die Beurteilung zoonotischer Krankheitserreger beim Menschen und können auch auf wichtige Tierarten wie Rinder, kleine Wiederkäuer und Schweine übertragen werden, die Anfälligkeit für mehrere infektiöse und zoonotische Erreger teilen. Es wird erwartet, dass z. B. bei einem Ausbruch grundlegende Laboratorien in der Nähe betroffener Gebiete in der Lage sein werden, schnell und präzise eine Ätiologie mit den vorgeschlagenen Methoden bereitzustellen, und zwar nach den Routineverfahren der Gewebefixierung, die von den meisten Pathologieinstituten durchgeführt werden.