Verträglichkeit und Effektivität neuer synthetischer Adjuvantien bei der Erzeugung von Antikörpern gegen Synaptobrevin 2-Fragmente in der Balb/c-Maus

Abstract

Zur Entwicklung eines tierschonenden Immunisierungsschemas bei Mäusen wurden die Verträglichkeit und die Effizienz von verschiedenen Adjuvantien verglichen. Eingesetzt wurden dafür die ölhaltigen Adjuvantien Specol und Algen-LPS-Öladjuvans sowie die wasserlöslichen Adjuvantien Imject® Alum (Aluminiumhydroxid), ImmunEasy (CpG-Oligonukleotide), AdjuPrime (Algen-Glucan) und Diluvac forte (alpha-Tocopherol). Als Modellantigen wurde ein synthetisches, von dem Vesikelprotein Synaptobrevin 2 abgeleitetes Oktamer-Peptid (rSyb270-76) verwendet, das von der Tetanustoxin-Spaltstelle stammt. Das rSyb270-76 wurde an den Carrier KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) oder ChTxB (Choleratoxin Untereinheit B) gekoppelt und mit einem Adjuvans versetzt. Für die Studie wurden insgesamt weibliche 450 Balb/c-Mäuse eingesetzt. Zur Beurteilung der Verträglichkeit der Adjuvantien wurden das Allgemeinbefinden und Verhalten der Tiere, die Körpergewichtsentwicklung während der Studie und die makroskopisch sichtbaren Veränderungen am Injektionsort untersucht. Zudem wurden die pathohistologischen Befunde beurteilt und die Serumkonzentration der Akute-Phase-Proteine Haptoglobin und Serum-Amyloid-A bestimmt. Die Verwendung von Specol und ImmunEasy führte bei den immunisierten Mäusen zu einer nachweisbaren Störung des Wohlbefindens: Die Tiere zeigten nach den Impfungen ein deutlich ruhigeres Verhalten, ihr Fell war struppig und glanzlos, und sie wiesen abgekapselte Gewebeabszesse am Injektionsort auf. Die histologische Untersuchung der Injektionsstelle ergab eine starke Entzündungsreaktion des Gewebes. Bei den mit ImmunEasy geimpften Tiergruppen war ein signifikanter Körpergewichtsabfall nach den Impfungen feststellbar. Des Weiteren kam es nach den Immunisierungen zu einem deutlichen Anstieg der Akute-Phase-Proteine Haptoglobin und Serum-Amyloid-A in den Mäuseseren. Zur Beurteilung der Effizienz der Adjuvantien wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: ELISAs zum Nachweis von Antikörpern (IgG) gegen das Immunisierungspeptid und SDS-PAGE und Western Blots zum Nachweis von Antikörpern gegen das Modellantigen. Zur vergleichenden Bewertung der Effizienz der Adjuvantien wurden zusätzlich ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen die Carrierproteine KLH und ChTxB durchgeführt. In dieser Studie wurden die besten Immunisierungsergebnisse (starke Immunantwort im ELISA und im Western Blot) von dem ölhaltigen Adjuvans Specol und dem wasserlöslichen Adjuvans ImmunEasy geliefert. Diese Adjuvantien scheinen für die Immunisierung von Mäusen mit Peptidantigenen geeignet, denn auch ihre Nebenwirkungen sind als tolerierbar einzustufen. Alle übrigen Adjuvantien induzierten mit dem geprüften Modellantigen keine ausreichende Antikörperbildung. Sollten zur Immunisierung Peptidantigene verwendet werden, empfiehlt sich nach den in der Studie gewonnenen Daten die Kopplung an den Carrier KLH, da nur mit diesem Carrier eine zufrieden stellende Immunantwort induziert werden konnte. To develop an animal immunization scheme that is well-tolerated by mice, a comparison was made between the tolerance and efficiency of different adjuvants. For this purpose, use was made of the water-in-oil emulsion adjuvant Specol and the algae-LPS-oil-based adjuvant as well as of the water-soluble adjuvants Imject® Alum (aluminum hydroxide), ImmunEasy (CpG oligonucleotides), AdjuPrime (algae glucan) and Diluvac forte (alpha-tocopherol). A synthetic octamer peptide (rSyb270-76) derived from the vesicle protein Synaptobrevin 2 was chosen as a model antigen which originates from the cleavage site of the tetanus toxin. The rSyb270-76 was coupled to carrier KLH (keyhole limpet haemocyanin) or carrier ChTxB (cholera toxin subunit B) and charged with adjuvants. For the immunization experiments, a total of 450 female BALB/c mice were selected. To assess the tolerance, the animals´ general condition and behavior, the development of the body weight during the study as well as the macroscopically visible changes at the sites of injection were examined. Moreover, the pathohistological findings were evaluated, and the sera concentration of the acute-phase proteins haptoglobin and serum amyloid A (SAA) was determined. The use of Specol and ImmunEasy resulted in a detectable damage to the well-being of the immunized mice:After immunization, the animals revealed markedly quieter behavior, their coat of fur was dull and scruffy, and they exhibited encapsulated abscesses of the tissue at the injection sites. The histological examination of the injection sites revealed a clear inflammatory response of the tissue. In the event of the groups of animals immunized with ImmunEasy , not only a significant decline of the body weight could be observed after immunization but also a considerable increase of the acute-phase proteins haptoglobin and serum amyloid A in the mice sera. For the assessment of the efficiency of the adjuvants, the following examinations were carried out: ELISAs to prove the existence of antibodies (IgG) against the immunization peptide and SDS-PAGE and Western blots to detect the antibody production against the model antigen. For a comparative evaluation of the efficiency of the adjuvants applied, ELISAs were additionally performed to furnish proof of the production of antibodies against carrier proteins KLH and ChTxB. In this study, the best immunization results (clear immune response in the ELISA and in the Western blot) were achieved from the water-in-oil emulsion adjuvant Specol and the water-soluble adjuvant ImmunEasy . These adjuvants seem to be suitable for the immunization of mice with peptide antigens because of their tolerable side effects. All other adjuvants did not induce a sufficient production of antibodies with the tested model antigen. Should peptide antigens be used for immunization, it is recommended, on the basis of the data obtained in the study, to couple them to carrier KLH since a satisfactory immune response could only be induced with that carrier.