Einfluss von HDAC-Inhibitoren auf die tumorinduzierte Angiogenese in der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2

Abstract

Die Angiogenese ist von essentieller Bedeutung für das Wachstum und die hämatogene Metastasierung solider Tumore. Ihre Hemmung stellt eine vielversprechende Methode der Tumortherapie dar. Es werden zunehmend Hinweise dafür gefunden, dass Hemmstoffe von Histondeacetylasen (HDACs) antiangiogene Potenz besitzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden diesbezüglich Valproat, Butyrat und Trichostatin A untersucht. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass diese HDAC-Inhibitoren als wirkungsvolle Hemmstoffe tumorinduzierter Angiogenese gelten können. Anhand verschiedener in vitro Angiogenesemodelle ließ sich zeigen, dass Valproat, Butyrat und Trichostatin A in der Lage sind, angiogeneserelevante Endothelzellfunktionen zu hemmen. So wurden die Proliferation, die Migration und die Ausbildung kapillarähnlicher tubulärer Strukturen von human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) durch die Testsubstanzen zum Teil signifikant reduziert. An der Induktion der Angiogenese sind Wachstumsfaktoren wie der fibroblast growth factor (FGF-2) und der vascular endothelial growth factor (VEGF) maßgeblich beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde unter anderem untersucht, ob Valproat, Butyrat und Trichostatin A ihre antiangiogene Wirkung möglicherweise über eine Beeinflussung dieser bedeutenden proangiogenen Faktoren entfalten. Die vorgestellten Ergebnisse zur Sekretions- und Expressionshemmung von FGF-2 und VEGF auf Protein- bzw. mRNA-Ebene bestätigten diese Überlegung. Ein vorgeschaltetes Signalmolekül in der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese ist der hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha). Es konnte nachgewiesen werden, dass Valproat, Butyrat und Trichostatin A die Expression dieses Transkriptionsfaktors im Gesamthomogenat von Caco-2 Zellen induzieren. Die Aktivität von HIF-1& #945; in der nukleären Caco-2 Fraktion wurde dagegen reduziert. Diese Resultate lassen sich möglicherweise auf eine Hemmung der nukleären Translokation von HIF-1alpha zurückführen. Desweiteren ließ sich zeigen, dass die proteasomale Aktivität im Caco-2 Zelllysat durch Valproat, Butyrat und Trichostatin A zum Teil signifikant vermindert wurde. Dementsprechend liegt der deutlichen zytoplasmatischen Akkumulation des HIF-1alpha Proteins wahrscheinlich auch eine Hemmung der proteasomalen Degradierung durch die Behandlungssubstanzen zugrunde. Als Konsequenz dieser Ergebnisse wurde die Hypothese aufgestellt, dass die antiangiogene Wirkung der Testsubstanzen über eine Unterbrechung des HIF-1alpha Signals vermittelt wird. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass HDAC-Inhibitoren über eine Beeinflussung der PI3K/AKT Signaltransduktionskaskade möglicherweise auch die Synthese von HIF-1alpha stören. Dies konnte zumindest für Butyrat und Trichostatin A belegt werden. Für Valproat sind diesbezüglich weiterführende Untersuchungen nötig. Angiogenesis is of essential importance for the growth and metastasis of solid tumors. Its inhibition may be a valuable approach in cancer therapy, representing an important aspect of future treatment. Recent studies indicate that inhibitors of histondeacetylases are potent antiangiogenic agents. The subject of this work was to evaluate the antiangiogenic effects of the HDAC-inhibitors valproate, butyrate and trichostatin A. Our results indicate that the tested substances supposed to be effective inhibitors of tumor-derived angiogenesis. Valproate, butyrate and trichostatin A appeared to be able to inhibit endothelial cell functions relevant for angiogenesis in different in vitro angiogenesis assays. Proliferation, migration as well as tube formation of HUVECs were suppressed by all tested drugs, at least partly in a significant manner. Angiogenesis is induced by angiogenic growth factors such as fibroblast growth factor (FGF-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF). One aim of this study was to find evidence for the thesis that valproate, butyrate and trichostatin A exert their antiangiogenic effects through a modulation of these important angiogenic factors. This consideration could be confirmed by decreased protein and mRNA levels of FGF-2 and VEGF. Hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) is a proceeding signal molecule of growth factor induced angiogenesis. Valproate, butyrate and trichostatin A proved to induce the expression of this transcriptional factor in the whole cell lysat of Caco-2 cells. However, the HIF-1alpha DNA-binding activity in the nuclear extract of Caco-2 cells was reduced, which can possibly be explained by an inhibition of nuclear translocation of HIF-1alpha. Further results could show that valproate, butyrate and trichostatin A led to a partly significant suppression of proteasome activity in the Caco-2 cell lysat. Thus, the marked cytoplasmatic accumulation of HIF-1alpha protein, as observed in our experiments, is probably due to the inhibitory effects of valproate, butyrate an trichostatin A on the ubiquitin-proteasome pathway.Summarizing our findings we concluded that the antiangiogenic effects of the tested substances are caused by a disruption of HIF-1alpha signaling. Furthermore we assumed HDAC-inhibitors to be able to influence the HIF-1alpha synthesis by modulating the PI3K/AKT pathway. This could be verified at least for butyrate and trichostatin A. Concerning valproate further examinations are needed.