Expression des Activator of CREM in Testis (ACT) bei normaler und gestörter Spermatogenese verschiedener Spezies

Abstract

Für die Bildung befruchtungsfähiger Spermien ist eine strenge zeitliche und stadienspezifische Koordination der Genexpression während der Spermatogenese Voraussetzung. Bei der Regulation der Genexpression in haploiden Spermatiden spielt der Transkriptionsfaktor cAMP-responsive element modulator (CREM) eine entscheidende Rolle, da er über eine Bindung an die CRE-Box, die in der Promotorregion seiner Zielgene lokalisiert ist, zu einer Aktivierung für die Spermatogenese wichtiger Proteine, wie beispielsweise der Protamine, führt. Die Steuerung der transkriptionalen Aktivität von CREM erfolgt in Keimzellen im Gegensatz zu somatischen Zellen phosphorylierungsunabhängig durch den hodenspezifischen activator of CREM in testis (ACT). ACT tritt bei normaler Spermatogenese als nukleäres Protein stadienspezifisch in runden und elongierten Spermatiden auf und wird im Keimepithel mit CREM koexprimiert. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, erstmals die Genexpression und die Lokalisation der Transkripte von ACT bei normaler Spermatogenese sowie bei Spermatidenreifungsdefekt exemplarisch bei Mensch, Affe (Macaca fascicularis), Maus und Pferd darzustellen und in diesem Zusammenhang eine mögliche Assoziation einer abnormen Expression von ACT mit männlicher Infertilität nachzuweisen. Mittels RT-PCR und in-situ Hybridisierung (ISH) gelang es, die ACT-mRNA im Hodengewebe zell- und stadienspezifisch darzustellen. Bei normaler Spermatogenese konnte mit Hilfe der RT-PCR bei Mensch, Affe und Maus ein Amplifikat gewonnen werden, welches durch Sequenzierung eindeutig als ACT identifiziert wurde. Durch die ISH konnte bei Mensch, Affe, Maus und Pferd die ACT-mRNA in Spermatozyten des mittleren und späten Pachytäns sowie in runden Spermatiden nachgewiesen werden. Von den infertilen Männern mit Spermatidenreifungsdefekt zeigte nur ein Patient ein starkes Signal für ACT, wohingegen die restlichen Patienten sowohl bei RT-PCR als auch bei ISH lediglich ein schwaches Signal ausbildeten. Interessanterweise exprimierten auch CREM knock-out Mäuse, von denen bekannt ist, daß sie aufgrund eines Spermatogenesearrests auf der Stufe von runden Spermatiden unfruchtbar sind, nur ein schwaches Amplifikationsprodukt für ACT. ACT-mRNA war in einigen runden Spermatiden in schwacher Ausprägung nachweisbar, fehlte aber in pachytänen Spermatozyten. Die Ergebnisse dieser Studie lassen eine Rolle von CREM bei der ACT-Aktivierungvermuten. Das Fehlen bzw. die verminderte Expression von ACT bei Spermatidenarrest deuten auf eine wichtige Rolle bei der Differenzierung runder Spermatiden in befruchtungsfähige Spermien hin. For the production of fertile spermatozoa, the stringent temporal and stage-specific coordination of gene expression during spermatogenesis represents a prerequisite. A key role in the regulation of gene expression in haploid spermatids plays the transcription factor cAMP-responsive element modulator (CREM), which activates postmeiotic genes with high importance for spermatid differentiation, such as protamines, through binding to the CRE-box localized in the promoter region of its target genes. Contrary to somatic cells, in germ cells, the control of the transcriptional activity of CREM takes place in a phosphorylation-independent manner by the testis-specific activator of CREM in testis (ACT). Previous studies demonstrated ACT as a nuclear protein in round and elongated spermatids coexpressed with CREM within the normal seminiferous epithelium. The aim of the present study was to evaluate gene expression and localization of ACT transcripts in both normal and impaired spermatogenesis of man, cynomolgus monkey (macaca fascicularis), mouse and stallion and thereby uncover a possible association between an aberant ACT expression and male infertility. Applying RT-PCR and in-situ hybridization (ISH), we succeeded in demonstrating the cell- and stage-specific distribution of ACT-mRNA in testicular tissue. During normal spermatogenesis, RT-PCR resulted in an amplicon in man, monkey and mouse, which after sequencing could clearely be identified as ACT. ISH revealed ACT-mRNA in mid and late pachytene spermatocytes and in round spermatids in man, cynomolgus monkey, mouse and stallion. Among infertile men with round spermatid maturation arrest, only one patient showed a strong signal for ACT, while the other patients displayed only a weak signal with both RT-PCR and ISH. In addition, CREM knock-out mice known to be infertile due to round spermatid maturation arrest also exhibited only a weak amplification product for ACT. ACT-mRNA was barely detectable in some round spermatids and was completely absent in pachytene spermatocytes. These data indicate a role for CREM in ACT transcriptional regulation. The complete lack or decreased expression of ACT in patients with round spermatid maturation arrest suggests a vital role of ACT for the differentiation of round spermatids into fertile spermatozoa.