Experimentelle Infektion von Kälbern mit Escherichia coli 0104:H4

Abstract

Mit dem EHEC-Stamm des Serotyps O104:H4 trat im Jahr 2011 ein neuartiger E. coli Stamm auf, der die Eigenschaften zweier verschiedener E. coli-Pathovare - der Shigatoxin-bildenden E. coli (STEC) und der enteroaggregativen E. coli (EAEC) - verband. EAEC-Stämme konnten bislang nicht bei Rindern nachgewiesen werden, die das Hauptreservoir für STEC-Stämme darstellen. Da nicht auszuschließen ist, dass Stämme wie der EHEC-Stamm O104:H4 in Nutztierpopulationen eingetragen werden, ergab sich die Frage, ob Stämme mit solchen genetischen Merkmalen in der Lage wären, dauerhaft den Darm von Wieder¬käuern zu kolonisieren und somit die Speziesbarriere vom Menschen zum Tier zu überwinden.Unter Nutzung eines etablierten Infektionsmodels mit Kälbern wurden zwei Teilversuche (TV1 und TV2) mit einer Versuchsdauer von 4 d bzw. 28 d durchgeführt. Je Teilversuch wurden 5 ca. 100 Tage alte Kälber mit dem EHEC-Stamm des Serotyps O104:H4 (humanes Isolat LB226692 aus dem Ausbruchgeschehen 2011; stx2-positiv), und weitere je 5 Kälber mit dem STEC O157:H7-Stamm 86-24 Nal (Positiv¬kontrolle; stx2-positiv) bzw. mit dem kommensalen E. coli-Stamm 123 (Negativ¬kontrolle; stx-negativ) inokuliert. Alle Kälber blieben während der gesamten Versuchsdauer klinisch unauffällig. In 24 von 30 Tieren waren vor der Inokulation Shigatoxin 1 (Stx1) -neutralisierende Antikörper (Stx1-Ak) nachweisbar. Eines der Tiere inokuliert mit Stamm LB226692 entwickelte während des Versuches messbare anti-Stx1 Titer. Bei keinem der Kälber konnten vor der Inokulation oder am letzten Tag der Versuche Stx2-Ak nachgewiesen werden.Durch Bestimmung der Zahl Kolonie-bildender Einheiten (KbE), Beurteilung der Kolonie-morphologie und Bestätigung des Serotyps wurde die Keimzahl des entsprechenden Inokulations¬stammes im Kot bestimmt und die Ergebnisse über Koloniehybridisierung und Multiplex-PCR bestätigt. In allen Inokulationsgruppen variierten die Dauer und Höhe der fäkalen Ausscheidung stark. Der Stamm LB226692 wurde am ersten und zweiten Tag nach Inokulation (dpi) mit einer maximalen Keimzahl von 2,4 x 107 KbE/g Kot ausgeschieden. Die Ausscheidung variierte 4 dpi zwischen fehlendem Nachweis und einer Ausscheidung von 6,6 x 105 KbE/g Kot. Im weiteren Versuchsverlauf fiel die Menge ausgeschiedener Bakterien des Stammes LB226692 bis unter die Nachweisgrenze ab, war jedoch bei einem Tier bis 24 dpi nachweisbar. Vier Tage nach Inokulation konnte der Stamm sowohl im Darminhalt (bis zu 5,6 x 107 KbE/g) als auch assoziiert mit dem Darmgewebe nachgewiesen werden. Der Nachweis gelang aus dem Pansen, dem Lab¬magen¬inhalt und der Galle. Ähnlich wie der Kontrollstamm 86-24 Nal war LB226692 nur vereinzelt mit Dünndarmgewebe assoziiert. Im Übergang zum und im Dickdarm erfolgte der Nachweis bei 4 Tieren an allen Beprobungs-punkten mit bis zu 1,3 x 107 KbE/g Darmgewebe. Bei 3 Tieren wurde LB226692 an der rektoanalen Übergangszone mit bis 6,5 x 106 KbE/g Darmgewebe nachgewiesen. Bei der Sektion 28 dpi war LB226692 weder im Darminhalt noch am Darmgewebe nachweisbar.Keines der Tiere wies 4 dpi signifikante makroskopische oder histologische Veränderungen der Dünn- oder Dickdarmschleimhaut auf. Adhärierende Bakterien des Stammes LB226692 waren bei einem Tier immunhistologisch an der kutanen Schleimhaut des Rektums, nicht jedoch im Bereich der dortigen Drüsenschleimhaut, zu finden. Bei diesem Tier traten spezifisch markierte Bakterien auch an mehreren ulzerativen Veränderungen der Darm-schleimhaut auf. Bei einem anderen Tier konnten spezifisch markierte E. coli des Stammes LB226692 im Nekrosebereich einer Tonsillarkrypte (Kryptabszess) nachgewiesen werden.Alle untersuchten Re-Isolate von LB226692 enthielten die ESBL-Genloki und das pESBL. Zehn Re-Isolate besaßen nach Tierpassage zusätzlich ein astA-Gen, das dem Ausbruchstamm fehlt. Dagegen hatten 116 von 315 untersuchten LB226692-Re-Isolaten das aggR-Gen und das entsprechende Plasmid (pAA) während der Tierpassage verloren. Der prozentuale Anteil aggR-negativer Einzelkolonien nahm über die Versuchsdauer kontinuierlich zu. Der EHEC-Stamm LB226692 des Serotyps O104:H4 ist somit in der Lage, den Darm von Wiederkäuern klinisch inapparent über einen bestimmten Zeitraum zu kolonisieren. Der Stamm ist in deutlich höheren Keimzahlen und über einen wesentlich längeren Zeitraum als der kommensale Stamm 123 nachweisbar, jedoch in geringeren Keimzahlen und kürzer als klassische STEC. Dies spricht für eine schlechtere Adaption des Stammes LB226692 an das bovine Intestinum als bei klassischen STEC, jedoch unterliegt der Stamm nachweislich wie auch andere E. coli-Stämme einem ständigen Wandel durch Aufnahme und Verlust von Genen für Virulenzfaktoren. Es ist deshalb davon auszugehen, dass Rinder als Reservoir für STEC/EAEC-Stämme und als Quelle einer Übertragung auf den Menschen fungieren können. In 2011, a novel enterohemorrhagic E. coli (EHEC) strain of serotype O104:H4, possessing a combination of virulence factors of both Shiga toxin (Stx)-producing E. coli (STEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC) strains, caused an unprecedent, food-borne outbreak in humans. E. coli strains belonging to the EAEC pathovar have not been detected in cattle, the primary STEC/EHEC reservoir, so far. As exposure of the cattle population to EHEC/EAEC hybrid strains like EHEC O104:H4 can occur, the current study aimed at assessing the possibility that strains with this genetic make-up can utilize ruminants as reservoir allowing such strains to cross the interspecies barrier from humans to livestock.We used a well decribed bovine infection model for two experiments lasting 4 and 28 d, respectively. In each trial, fifteen (five per strain) approx. 100-day-old weaned calves were inoculated with EHEC strain of serotype O104:H4 (LB226692; isolated from a human patient during the outbreak 2011; stx2-positive), with STEC O157:H7 strain 86-24 Nal (positive control; stx2-positive) or with non-pathogenic E. coli O43:H28 strain 123 (negative control; stx-negative). All calves remained clinically normal throughout the experiments. Before inoculation, neutralizing antibodies against Stx1 were detectable in 24 of 30 animals. One calf inoculated with strain LB226692 developed antibodies to Stx1 during the experiment. None of the calves had neutralizing antibodies against Stx2 before the inoculation or on the last day of the experiment.For quantification of the inoculum strains in feces, colony-forming units (CFU) were counted, colony morphology was evaluated, the serotype confirmed, and the results were approved by hybridization and multiplex PCR. Magnitude and duration of detectable shedding varied among individuals in all inoculation groups. Bacteria of EHEC strain LB226692 were shed in maximum numbers of 2.4 x 107 CFU/g feces on the first and second day post inoculation (dpi). Fecal shedding varied by 4 dpi between missing detection and 6.6 x 105 CFU/g feces. In the 28 d trial, numbers of LB226692 bacteria shed eventually decreased below the detection limit. However shedding was detectable until 24 dpi in a single animal. EHEC O104:H4 could be recovered from intestinal content (up to 5.6 x 107 CFU/g) as well as from mucosal tissue samples at 4 dpi. Isolation was possible from the rumen, the content of the abomasum and the bile. The outbreak strain LB226692, similar to the positive control strain 86-24 Nal, was only sporadically associated with the small intestinal mucosa. At the transition to and in the large intestine detection was possible in 4 animals at every sampling spot with up to 1.3 x 107 CFU/g tissue sample. In 3 animals LB226692 was detected at the rectoanal junction with up to 6.5 x 106 CFU/g tissue sample. At necropsy 28 dpi LB226692 was neither detectable in intestinal content nor associated with intestinal tissue.Gross pathological or histological abnormalities of the small or large intestinal mucosa were vastly absent in any of the calves 4 dpi. Adherent bacteria of strain LB226692 were immuno-histo¬chemically detectable in one calf at the squamous epithelium of the rectum, but not in the area of the columnar epithelium. In this calf, specifically stained bacteria were also found at several ulcerative alterations of the intestinal mucosa. In another calf E. coli of strain LB226692 were detectable in a necrotic area of a tonsillar crypt (crypt abscess).All tested re-isolates of LB226692 contained the ESBL gene loci and the pESBL. Ten re-isolates possessed an additional astA, which the outbreak strain lacked. In contrast, 116 of 315 LB226692-re-isolates had lost the aggR-gene and the corresponding plasmid (pAA) during animal passage. The percentage of aggR negative colonies steadily increased in the course of the experiment.In conclusion, EHEC strain LB226692 of serotype O104:H4 is able to colonize the intestine of ruminants asymptomatically for a significant period of time. The outbreak strain has been recovered in considerably higher numbers and for a longer time period than the commensal strain 123, but in lower numbers and for a shorter period than a classical STEC strain. EHEC O104:H4 appear to be less well adapted to bovine intestine as compared to classical STEC. However, E. coli strains are subject to a steady change through uptake and loss of genetic information encoding for virulence factors. It must be considered, therefore, that cattle can serve as reservoir for STEC/EAEC strains and a source of trans¬mission to the human population.