Untersuchungen zur Charakterisierung einer felinen Large Granular Lymphocyte (LGL)-Zelllinie

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, eine neu etablierte feline Large Granular Lymphocyte (LGL)-Zelllinie (S87) zu charakterisieren.2. In der Literaturübersicht wird zunächst allgemein auf die Large Granular Lymphocytes und deren Eigenschaften eingegangen. Bisher etablierte feline Lymphomzelllinien sowie deren Hauptcharakteristika werden vorgestellt. Zudem wird ein Überblick über Aspekte der genetischen Instabilität unter Berücksichtigung von Aneuploidie, Zentrosomenhyperamplifikationen sowie über p53-Mutationen und deren Bedeutung für die Tumorgenese gegeben.3. Die S87-Zellen wurden zytologisch, elektronenmikroskopisch, sowie immunzytologisch untersucht. Ebenfalls erfolgte eine Analyse der Wachstumscharakteristika. Die zytotoxische Aktivität wurde zum einen morphologisch mittels Rosettenformation dargestellt und zum anderen mit Hilfe des MTT-Tests berechnet.4. Molekularbiologische Untersuchungen erfolgten hinsichtlich des Rearrangements eines B-Zell- und T-Zell-Rezeptors, zum Nachweis eines FeLV-Provirus sowie für die Untersuchung auf p53-Mutationen. 5. Zur Bewertung der chromosomalen Instabilität erfolgten zytogenetische Untersuchungen der Metaphaseplatten sowie von Karyogrammen. Zentrosomenhyperamplifikationen konnten mittels Immunfluoreszenz durch den Nachweis von gamma-Tubulin nachgewiesen werden. 6. Mittels der beschriebenen Methoden konnte eine Zuordnung der S87-Zellen zu den zytotoxischen T-Zellen, welche sich durch eine spontane zytotoxische Aktivität auszeichnen, erfolgen. Eine deutliche Anisozytose, Anisokaryose sowie hohe Mitoserate sind hinweisend für einen hohen Malignitätsgrad des Orignaltumors. S87 weist eine chromosomale Instabilität auf, welche mit einer Zentrosomenhyperamplifikation einhergeht. In Passage 10 zeigten 55 % der Zellen eine signifikante Abweichung von der euploiden felinen Chromosomenzahl (2n=38), in Passage 80 sogar 81 %. Bei der Erstellung der Karyogramme zeigte sich in beiden Passagen, dass sich nicht nur bei den Chromosomensätzen mit 2n ungleich 38, sondern auch bei den Chromosomensätzen mit 38 Chromosomen kein korrektes Karyogramm zusammensetzen lies. Bedingt war dies durch Chromosomenverluste und Duplikationen, mit dem Ergebnis verschiedenster Monosomien sowie Trisomien. Dabei zeigte sich eine Häufung der numerischen Aberrationen in der Gruppe C der felinen Chromosomen. Eine stille p53-Mutation konnte im kodierenden und eine weitere im nicht abgelesenen Bereich nachgewiesen werden. 7. Mit S87 konnte erstmals eine FeLV-negative LGL-Zelllinie etabliert und charakterisiert werden, bei der eine Zuordnung zu den zytotoxischen T-Zellen erfolgen konnte. Die Zelllinie kann somit Grundlage für weitere Forschungsprojekte sein, wie zum Beispiel die Untersuchung potenzieller Chemotherapeutika zur Behandlung dieser aggressiven Tumorform.

The aim of this study was to characterize a newly established feline large granular lymphocyte (LGL) cell line (S87).2. In a review of the literature large granular lymphocytes and their characteristics are described. Furthermore an overview of the established feline lymphoma cell lines is given. Genetic instability, most notably aneuploidy and centrosome hyperamplification, as well as p53 mutations are reviewed in the context of their relevance for tumorigenesis.3. Cytology, electron microscopy, and immunocytochemistry were used to characterize S87 cells. Additionally, analysis of the growth characteristics of this cell line was performed. Spontaneous cytotoxic activity was assessed using MTT assay and rosette formation. 4. Rearrangement of B cell and T cell receptors, existence of FeLV provirus, and p53 mutations were analyzed by molecular techniques.5. To assess chromosomal instability, cytogenetic analysis of metaphase plates and the karyotype of the S87 cells was carried out. Centrosome hyperamplification was analyzed by detection of gamma-tubulin using immunofluorescence.6. S87 cells could be classified as cytotoxic T cells with spontaneous cytotoxic activity. Anisocytosis, anisokaryosis and a high mitotic index may indicate a high degree of malignancy of the original tumor. Fiftyfive percent of the cells in passage 10 and 81% of the cells in passage 80 showed a significant aberration from the normal, euploide feline chromosome number (2n = 38). Karyotype analysis revealed that not only chromosome sets with 2n unequal 38, but also sets with 2n = 38 showed an irregular karyotype. That was due to losses and duplications of chromosomes leading to various monosomies and trisomies. Abberations were most frequently detectable in the chromosomes of group C. Chromosomal instability was associated with a centrosome hyperamplification. A silent mutation and an additional mutation in the non-coding region of p53 was detected. 7.With S87 the first FeLV-negative LGL cell line derived from cytotoxic T cells could be established and characterized. This gives the possibility to use the cell line for further investigations and examinations, e.g. to investigate chemotherapeutic agents for the treatment of this aggressive tumor type.