Untersuchungen zur Bedeutung der sterol regulatory element-binding proteins in der Regulation des Natrium-Iodid-Symporters in Milchdrüsenzellen

Abstract

Der Natrium-Iodid-Symporter (NIS) ist ein wichtiges Protein im Iod-Haushalt der Säugetiere. Er ist notwendig für die Aufnahme von Iodid über den Darm in die Blutbahn und somit für die Versorgung des Organismus mit diesem essentiellen Spurenelement. Da es sich bei Iodmangel um ein weltweites Problem handelt, ist es von großem Interesse, mehr über die Regulation des NIS zu erfahren. Besonders verheerend wirkt sich ein Iodmangel bei Ungeboren, Säuglingen und Kleinkindern aus, bei denen hochgradige Entwicklungsstörungen beobachtet werden können. Um dies zu verhindern, ist eine ausreichende Iodversorgung der Mutter während der Schwangerschaft und Stillzeit wichtig und zeigt die wesentliche Bedeutung des NIS in der Milchdrüse. In kürzlich durchgeführten Studien konnte gezeigt werden, dass der NIS in Schilddrüsenzellen neben der primären Regulation durch Thyreotropin (TSH, Thyreoidea stimulierendes Hormon) auch durch die sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) reguliert wird. Die SREBPs sind als Transkriptionsfaktoren aus dem Lipid- und Cholesterinstoffwechsel bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die Hypothese zu untersuchen, dass SREBPs auch in der Milchdrüse als Regulatoren des NIS fungieren. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der in vitro-Regulation des NIS in MCF-7-Zellen, einer humanen Brustadenokarzinomzelllinie. Die basale NIS-Expression in dieser Zelllinie ist aber so gering, dass sie in einigen Versuchen durch all-trans Retinsäure (atRA) gesteigert werden musste. Es konnte gezeigt werden, dass eine Ausreifungshemmung der SREBPs mit dem potenten Inhibitor 25-Hydroxycholesterin (25-HC) zu einer signifikant erniedrigten NIS-Expression führt. Auch nach Knockdown von SREBP-1c und SREBP-2 mittels RNA-Interferenz (RNAi) wurden signifikant niedrigere mRNA-Konzentrationen des NIS gemessen. Eine Überexpression von SREBP-1c, bzw. SREBP-2 mit sequenzspezifischen Expressionsvektoren führte zu einer signifikant erhöhten NIS-Expression. Mit der Messung des Radioiodid-Uptakes konnten die gesammelten Daten untermauert werden. Es konnte eine signifikant niedrigere Iodid-Aufnahme nach Behandlung mit 25-HC gemessen werden. Um zu zeigen, dass das humane NIS-Gen in der Milchdrüse durch SREBPs transkriptionell reguliert wird, sollte anschließend eine Bindungssequenz für SREBPs im humanen NIS-Gen lokalisiert werden. Der Sequenzvergleich des humanen Promotorbereichs mit dem von Ratte und Maus zeigte keine hohe Homologie. Für die Reportergenstudien wurde ein 1600 bp umfassender Bereich der 5´-flankierenden Region des humanen NIS-Gens in 4 Fragmente unterteilt und einzeln untersucht. In zwei dieser Fragmente konnte eine gesteigerte Luziferase-Aktivität nachgewiesen und somit mindestens ein SRE detektiert werden. In den beiden DNA-Fragmenten -280/+259 und -1250/-930 konnten in silico insgesamt neun putative SREs identifiziert werden, von denen bereits eins als funktionales SRE ausgeschlossen werden konnte. Der Vergleich dieser putativen Bindungssequenzen zwischen den drei Spezies Rattus norvegicus, Mus musculus und Homo sapiens zeigte keinen hohen Konservierungsgrad. Evolutionär bedeutsame Mechanismen sind auf DNA-Ebene hoch konserviert und zeigen dementsprechend eine hohe Homologie auch zwischen verschiedenen Spezies.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die SREBP-abhängige Regulation des NIS in der laktierenden Milchdrüse von Ratten untersucht. Die Versuchstiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt, eine Kontroll- und eine Versuchsgruppe. Die Tiere der Versuchsgruppe erhielten eine Diät mit conjugated linoleic acids (CLAs), von denen ein inhibitorischer Effekt auf die Milchfettsynthese bekannt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Tiere der Versuchsgruppe signifikant erniedrigte mRNA-Konzentrationen von SREBP-1c, dessen Zielgenen und des NIS aufwiesen. Auch dieses Experiment unterstützt die Beobachtung, dass der NIS in der Milchdrüse durch SREBPs reguliert wird.Bislang war bekannt, dass der Hauptstimulus des NIS der Saugakt ist. Die vorliegende Arbeit zeigt nun einen neuen Regulationsmechanismus auf und ergab klare Hinweise darauf, dass der NIS in der Milchdrüse, ebenso wie in der Schilddrüse, SREBP-abhängig reguliert wird. Diese Erkenntnis ist ein wichtiger Schritt für das vollständige Verständnis der Regulationsmechanismen des NIS und eröffnet neue Wege um den Transport von Iod in die Milchdrüse besser zu verstehen. The sodium-iodide symporter (NIS) plays a key role in iodine balance of mammals. It is required for the iodide uptake from the intestine into the blood stream, hence for the adequate supply of the organism with this essential trace element. Because iodine deficiency is a global problem it is of great value to learn more about the regulation of NIS. Iodine deficiency is devastating particularly in unborn children, nurslings and infants where drastic developmental disabilities occur. To avoid this problem it is necessary to guarantee a sufficient iodide uptake during pregnancy and nursing. These facts show the essential role of NIS in the mammary gland. Recent studies showed that NIS is regulated by sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) beside the primary regulation by thyroidea stimulating hormone (TSH) in rat thyroidal cells. SREBPs are transcription factors which are known as regulators of the lipid and cholesterol metabolism. The present study was designed to test the hypothesis weather NIS is regulated by SREBPs in the mammary gland. The first part of this thesis dealed with the in vitro regulation of NIS in the human breast cancer cell-line, MCF-7. The basal expression of NIS in these cells is very low, so it had been increased by all-trans retinoic acid (atRA) in some experiments. It was possible to show a significantly decreased NIS-expression after treatment with 25-hydroxycholesterol (25-HC), a potent inhibitor of SREBPs. Transfection with knockdown siRNAs targeting SREBP-1c and SREBP-2 also caused a significantly reduced mRNA concentration of NIS. Overexpression of both SREBP isoforms with sequence-specific expression vectors resulted in a significantly increased NIS-expression. NIS-specific iodide uptake was significantly lower after treatment with 25-HC. This result corresponds to the previous findings. To examine the transcriptional regulation of the human NIS-gene in the mammary gland by SREBPs, a SREBP-binding site should be localized in the human NIS-gene. Sequence alignment of the human promotor region with rat and mouse promotor region showed no high homology. An approximately 1600 bp sequence of the 5´-untranslated region was segmented into four fragments and analyzed by reporter gene assay. Two of these fragments showed a significantly increase in luciferase activity, what indicates the existence of at least one sterol regulatory element (SRE). The in silico analysis showed nine putative SREs in the fragments -280/+259 and -1250/-930. One of these putative SREs could be excluded as a functional SRE already. Sequence comparison of these eight putative SREs between rattus norvegicus, mus musculus and homo sapiens showed only a low degree of conservation. It is known that evolutionary important mechanisms are highly conserved and show a high degree of homology between different species.The SREBP-dependent regulation of NIS in rat lacting mammary gland was examined in the second part of this thesis. The animals used for this experiment where divided into two groups. The animals of the test group where fed with a diet containing conjugated linoleic acids (CLAs). It is known that CLAs are potent inhibitors of milk fat synthesis. Animals fed with the CLA-diet showed a significantly decreased mRNA-concentration of SREBP-1c, its target genes and NIS. This experiment supports the observation of SREBP-dependent regulation of NIS in the mammary gland.Suckling is the main stimulus of NIS. This thesis shows a new regulatory mechanism and gives clear indications for a SREBP-dependent regulation in mammary gland NIS. This knowledge is an important step in the complete understanding of NIS regulation and opens new opportunities for a better understanding of iodine transport into the mammary gland.