Untersuchungen zur Shigatoxin-Bildung bei Escherichia coli-Stämmen von Hausschweinen

Abstract

An 365 porcinen Stx2e-kodierenden E. coli-Isolaten (STEC-2e) von Schweinen wurde geprüft, ob diese das Shigatoxin vom Subtyp 2e (Stx2e) in vitro bilden und freisetzen können. Der Stx2e-Nachweis erfolgte mit dem Verozell-Zytotoxizitätstest (Vero-ZT) und mit einem selbst etablierten Stx2e-ELISA. Bei 30 ausgewählten STEC-2e-Stämmen wurde geprüft, ob antibakterielle Noxen wie UV-Licht, Mitomycin C (MMC) und die Antiinfektiva Amoxicillin, Colistin, Enrofloxacin, Erythromycin, Neomycin und Tetrazyklin die Freisetzung von Stx2e und stx2e-kodierenden Bakteriophagen stimulieren. Die Antiinfektiva wurden stammspezifisch in der jeweiligen minimalen Hemmkonzentration (MHK) eingesetzt. Das freie Stx2e wurde in den Kulturen mit und ohne Einwirkung einer Noxe mit dem Stx2e-ELISA bestimmt. Die Anregung der 30 STEC-2e-Stämme zur Freisetzung von lytischen Bakteriophagen erfolgte mit Norfloxacin und derjenigen Noxe (Antiinfektivum, MMC oder UV-Licht), die auf die Stx2e-Freisetzung jeweils am stärksten stimulierend gewirkt hatte. Die Prüfung auf Bakteriophagen erfolgte im Plaquetest. Zur Untersuchung von E. coli-Stämmen und Bakteriophagen-haltigen Kulturüberständen auf Virulenzgene fanden verschiedene PCRs Anwendung. Nach Anzucht unter Standardbedingungen war Stx2e bei 357 (97,8 %) der 365 untersuchten STEC-2e-Stämme mittels Vero-ZT im Kulturüberstand nachweisbar. Wegen der höheren Nachweisgrenze des Stx2e-ELISA (ca. 600 CD50/ml) reagierten hier die Kulturüberstände von nur 79 Stämmen (21,6 %) positiv. Die Messwerte aus Stx2e-ELISA und Vero-ZT korrelierten signifikant positiv miteinander (p < 0,001). Nach den Ergebnissen im Stx2e-ELISA war Stx2e bei 158 Stämmen (43,3 %) ausschließlich zellassoziiert nachweisbar, bei 41 Stämmen (11,2 %) nur im Kulturüberstand und bei 38 Stämmen (10,4 %) in beiden Kompartimenten. Bezüglich der subzellulären Stx2e-Lokalisation bestanden Unterschiede in Abhängigkeit vom Virulenzgenprofil der Stämme: Die typischen Ödemkrankheitserreger (EDEC; stx2e+, fedA+) wiesen signifikant höhere Gehalte an zellassoziiertem Stx2e auf als andere Stämme (p < 0,001). Umgekehrt waren bei den sonstigen STEC-2e- (stx2e+) und den EDEC/ETEC-Stämmen (stx2e+, fedA+, estap+/estb+/elt+) signifikant höhere Mengen an Stx2e im Kulturüberstand vorhanden als bei EDEC-Stämmen (p < 0,001). Bei 11 (36,7 %) der 30 Stämme induzierte wenigstens eine der nachfolgend genannten Noxen einen Anstieg der Stx2e-Konzentration im Kulturüberstand: UV-Licht, MMC, Amoxicillin, Enrofloxacin und Neomycin. Am stärksten nahm die Stx2e-Konzentration (bis zu 50,8-facher Anstieg) unter dem Einfluss von MMC, UV-Licht oder Enrofloxacin zu. Am häufigsten konnte die Stx2e-Freisetzung bei EDEC-Stämmen stimuliert werden (7 von 10 Stämmen, 70 %). Sowohl nach der Behandlung mit Norfloxacin als auch nach der Behandlung mit der jeweils zweiten eingesetzten Noxe war bei 12 der 30 STEC-2e-Stämme (40 %) Plaque-bildende Aktivität im Kulturüberstand nachweisbar. Hinsichtlich der Menge an freigesetztem Stx2e unterschieden sich diese Stämme im Mittel aber nicht von den im Plaquetest negativen Stämmen. Das Auftreten von Plaque-bildender Aktivität korrelierte auch nicht mit der Klassifikation der Stämme in EDEC, EDEC/ETEC oder sonstige STEC-2e. Bei keinem der 30 Stämme war ein stx2e-kodierender Bakteriophage induzierbar. Die Ergebnisse zeigen, dass nahezu alle STEC-2e-Stämme in vitro zur Stx2e-Bildung und -Freisetzung fähig sind. Im Vergleich zu humanen STEC sind die von porcinen STEC-2e-Stämmen freigesetzten Mengen aber gering. Stx2e scheint bei vielen E. coli-Stämmen aus der Bakterienzelle sezerniert und nicht erst bei der von Bakteriophagen verursachten Bakterienzelllyse freigesetzt zu werden. Stx2e-Bildung und/oder Stx2e-Freisetzung sind offenbar stammspezifisch reguliert, weshalb die im Darm infizierter Schweine freigesetzte Stx2e-Menge von den spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Stammes abhängig sein dürfte und gegenwärtig ohne gezielte Laboruntersuchungen nicht prognostiziert werden kann. Es ist damit zu rechnen, dass die Applikation von bestimmten Antiinfektiva die Stx2e-Freisetzung der EDEC-Stämme auch in vivo stimuliert und damit den Ausbruch von Ödemkrankheit oder deren Exazerbation provozieren kann.