Expression von Inhibin und Aktivin im Hoden im Verlauf der Rekrudeszenz der Spermatogenese nach Downregulation mit einem GnRH-Implantat beim Rüden

Abstract

Die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse ist für die neuroendokrine Regulation der Reproduktion verantwortlich. Infolge eines negativen Feedback-Mechanismus reguliert Testosteron die Gonadotropin-Sekretion (Luteinisierendes Hormon, LH, und Follikelstimulierendes Hormon, FSH). Die Feinregulation der FSH Sekretion erfolgt durch die Glykoproteine Aktivin (stimulierend) und Inhibin (hemmend) bzw. Follistatin (hemmend auf Aktivin), welche demnach einen gravierenden Einfluss auf die Kontrolle des Keimepithelzyklus ausüben.Ziel der Arbeit war es, die Expression von Aktivin und Inhibin im caninen Hoden zum Zeitpunkt der Downregulation infolge der Behandlung mit einem slow-release GnRH Agonist-Implantat und während der Rekrudeszenz der Spermatogenese näher zu charakterisieren. Hierzu wurden Untersuchungen zum Nachweis der drei Subunits Inhibin alpha, beta A und beta B, auf mRNA- und Proteinebene durchgeführt. Nach einer fünfmonatigen Behandlungsdauer mit einem Gonazon®-Implantat (18,5 mg Azagly-Nafarelin) wurden 37 adulte Beagle-Rüden in Gruppen von 3-4 Tieren in dreiwöchigem Abstand (Woche 0, 3, 6, 9, , 24) chirurgisch kastriert. Um den Einfluss des GnRH-Agonisten auf den Status der Downregulation näher zu untersuchen, wurden je drei Rüden mit einem 4,7 mg Deslorelin (Suprelorin®, SG)- Implantat bzw. einem 6,3 mg Buserelin-Implantat (Profact® Depot, PG) behandelt und nach fünf Monaten kastriert. Die Ergebnisse wurden mit einer adulten, unbehandelten Kontrollgruppe (n = 5, CG) sowie juvenilen Tieren (n = 3, JG) verglichen. Die Gruppeneinteilung der Hunde erfolgte zum einen anhand der Kastrationszeitpunkte (Woche 0, 3, 6, 9, 12, 24) und zum anderen anhand histologischer Kriterien, d. h. anhand der am weitesten entwickelten Keimzellen [DG A (Spermatozyten), DG B (runde Spermatiden), DG C (elongierende Spermatiden) und DG D (elongierte Spermatiden)].Auf mRNA-Ebene gelang mittels RT-PCR und qPCR in allen Gruppen zum Zeitpunkt der Downregulation und während der Rekrudeszenz der Spermatogenese, aber auch in der adulten und juvenilen Kontrollgruppe, der Expressionsnachweis aller drei Subunits. Für die alpha-Subunit konnten im Gruppen-Wochen Vergleich statistisch signifikante Unterschiede nachgewiesen werden (p = 0,0039), wobei die Expression in Wo 3 signifikant höher war als in Wo 9, 24 und in CG (p < 0,01-0,05). Beim Vergleich der downregulierten Tiere (Wo 0, SG, PG) mit der CG und JG waren ebenfalls signifikante Unterschiede verifizierbar (p = 0,0463), mit einer signifikant höheren Expression in SG verglichen mit CG (p < 0,05). Für die beta A-Subunit war zwischen den Wochen-Gruppen verglichen mit CG ein signifikanter Unterschied nachweisbar (p = 0,0026), wobei im Tukey-Test keine weiteren Signifikanzen verifiziert werden konnten, aber tendenziell die Expression in Woche 3 am höchsten war und dann bis Woche 24 abfiel. Die Expression der beta B-Subunit war beim Vergleich der DG mit CG signifikant verschieden (p = 0,0158), wobei sie bei DG A und B signifikant höher als in CG war (p < 0,05). Tendenziell konnte eine stete Abnahme der Expression auch im Wochen-Gruppen Vergleich gezeigt werden. Ebenso ergaben sich beim Vergleich der downregulierten Hoden mit CG und JG signifikante Differenzen (p = 0,0135) mit einer signifikant höheren Expression in Wo 0 und PG verglichen mit CG (p < ,05). Im Western Blot erwiesen sich die verwendeten Antikörper als spezifisch. In der Immunhistochemie zeigte sich auf Proteinebene für die Inhibin alpha-Subunit ein immunopositives Signal im Zytoplasma der Leydig- und Sertoli-Zellen. In den Sertoli-Zellen waren die immunopositiven Signale in DG B und JG besonders deutlich zu beobachten, während das Signal in CG am schwächsten war. Eine positive Farbreaktion zeigte sich für die beta A-Subunit in den peritubulären Zellen, den Sertoli-Zellen (außer Wo 0 und PG), Leydig-Zellen und Gonozyten (JG) bzw. Spermatogonien (außer DG D und CG). Für die Inhibin beta B-Subunit konnte bei allen Hunden eine Färbung der Gonozyten (JG) bzw. Spermatogonien und den je nach Entwicklungsstand der Spermatogenese weiter vorhandenen Keimzellen bis zu runden Spermatiden beobachtet werden.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Inhibin A und Aktivin A von Sertoli- und Leydig-Zellen produziert werden, Aktivin A zudem von peritubulären Zellen und Spermatogonien. Im Gegensatz dazu ist die Produktion von Aktivin B auf die Keimzellen beschränkt. Der erhöhte Nachweis von insbesondere Aktivin B zum Zeitpunkt der Downregulation und der frühen Rekrudeszenz deutet auf eine mögliche Rolle für die schnelle Aufregulation der Spermatogenese und auch das schnelle Anlaufen der Steroidbiosynthese hin. Den hohen Aktivin B-Konzentrationen folgt bereits in Woche 3 eine Aufregulation von Inhibin A, dem beim Hund dominanten Inhibin, welcher möglicherweise einer überschießenden Stimulation entgegensteuert. The hypothalamus-pituitary-gonadal axis is responsible for the neuroendocrine regulation of reproduction. Testosterone secretion regulates secretion of the gonadotropins (Luteinising Hormone, LH, and follicle stimulating hormone, FSH) by a negative feedback mechanism. The fine-tuning of FSH secretion is by the glycoproteins activin (stimulating) and inhibin (inhibiting) and follistatin (inhibiting activin), respectively, that consequently have an important influence on the control of the cycle of the seminiferous epithelium.The aim of the present thesis was to characterise the expression of activin and inhibin in the canine testis at the time of downregulation after treatment with a slowrelease GnRH agonist implant and during recrudescence of spermatogenesis. Investigations were performed on the mRNA and protein level to proof the presence of the three subunits inhibin alpha, beta_A and beta_B. Following a 5-month treatment with a Gonazon® implantat (18.5 mg azagly-nafarelin), 37 adult male Beagle dogs were randomly assigned to groups of 3-4 animals and were castrated in 3-week intervals (week, W, 0, 3, 6, 9, , 24). To further study the influence of the GnRH agonist on the state of downregulation, three dogs each were either treated with an implant containing 4.7 mg deslorelin (Suprelorin®, SG) or 6.3 mg buserelin (Profact® Depot, PG) and castrated 5 months later. The results obtained were compared to an untreated control group (n = 5, CG) and to juvenile animals (n = 3, JG). Grouping of dogs was according to their week of castration (week 0, 3, 6, 9, 12, 24) or according to the most developed germ cell observed [DG A (spermatocytes), DG B (round spermatids), DG C (elongating spermatids) and DG D (elongated spermatids)].On the mRNA level, we could proof the presence of all three subunits at the time of downregulation and during recrudescence but also in CG and JG using RT-PCR and qPCR. Significant differences were found comparing the week-of-castration groups (p = 0.0039) with a significantly higher ratio in week 3 compared to week 9, 24 and CG (p < 0.01-0.05). Significant differences between groups were also identified when comparing the downregulated animals (W0, SG, PG) with CG and JG (p = 0.0463), with a significantly higher expression in SG compared to CG (p < 0.05). The ratio of the beta_A-subunit was significantly different between weeks of castration compared to CG (p = 0.0026) whereas no further differences could be verified using the Tukey test, but there was a clear tendency of the highest expression in week 3 and a decreasing expression until week 24. Expression of the beta_B-subunit was significantly different comparing DGs and CG (p = 0.0158) with a significantly higher ratio in DG A and B compared to CG (p < 0.05). Comparing the week of castration-groups with CG, a clear tendency of a continuous decrease of the expression could be shown. Significant differences were further identified between the downregulated testes, CG and JG (p = 0.0135) with a significantly higher expression in week 0 and PG compared with CG (p < 0.05).Western Blot confirmed the specificity of the antibodies used. On the protein level, immunohistochemistry for the inhibin alpha-subunit revealed immunopositive staining in the cytoplasm of Leydig and Sertoli cells. In the Sertoli cells, strongest signals were detected in DG B and JG, lowest signals in CG. Positive immunostaining for the beta_A-subunit was found in peritubular cells, Sertoli cells (except for week 0 and PG), Leydig cells, gonocytes (JG) and spermatogonia (except for DG D and CG). Immunopositive signals for the inhibin beta_B-subunit were identified in gonocytes (JG) and spermatogonia and further germ cells stages up to round spermatids (if present). In conclusion, inhibin A and activin A are produced by Sertoli and Leydig cells; activin A is also produced by peritubular cells and spermatogonia. In contrast, production of activin B is restricted to germ cells. The proof of high concentrations of especially activin B at the time of downregulation and during the early recrudescence points to a possible role for the rapid upregulation of spermatogenesis and the rapid restart of steroidogenesis. High concentrations of activin B are followed by an upregulation of inhibin B, the predominant inhibin in the dog that might counteract an exaggerated stimulation.