In vivo Populationsdynamiken von genetisch modifizierten, reifen T-Zellen und Charakterisierung von anaplastischen, großzelligen T-Zell Lymphomen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Tumorgenese ALK-positiver T-Zell Lymphome und die Populationsdynamiken transplantierter, retroviral modifizierter monoklonaler T-Lymphozyten in vivo beobachtet. Weiterhin wurden experimentell induzierte, ALK-positive T-Zell Lymphome aus dem Mausmodell, dem humanen ALK-positiven ALCL (Anaplastic Large Cell Lymphoma, deut. Anaplastisch großzelliges Lymphom) gegenübergestellt.Damit die Verteilung und Aktivität der genetisch modifizierten Zellen mittels Biolumineszenzbildgebung in vivo verfolgt werden konnte, wurden bicistronische retrovirale Vektoren kloniert, welche für das Markergen Luciferase in Kombination mit dem Fusionsonkogen NPM-ALK oder dem Kontrollgen T-Sapphire (fluoreszierendes Protein) kodierten. Mithilfe eines gammaretroviralen Gentransfers wurden T-Zell-Rezeptor transgene OT-1-Spenderlymphozyten mit diesen Vektoren transduziert und anschließend in Rag-1-defiziente Empfängermäuse transplantiert. Sieben Wochen nach der Transplantation, wurden die Tiere im wöchentlichen Abstand hinsichtlich ihrer biolumineszenten Signale untersucht. Zusätzlich wurde die Repopulierung der transplantierten Zellen im peripheren Blut der Rezipienten kontrolliert, dadurch war es möglich die Zellen für bis zu 24 Wochen im lebenden Tier zu verfolgen. Es konnte gezeigt werden, dass die transplantierten Zellen die lymphopenischen Empfängertiere innerhalb weniger Wochen erfolgreich repopulierten. Die transplantierten Zellen siedelten sich überwiegend in abdominalen Lymphknoten und der Milz an, während sie außerhalb der Bauchhöhle vor allem in den linken inguinalen Lymphknoten einwanderten. Die Tumorgenese von ALK-positiven Lymphomen konnte in vivo induziert und ebenfalls über die Zeit beobachtet werden. Dabei fiel auf, dass die Latenzzeit der Entstehung eines Lymphoms anscheinend mit der Transduktionseffizienz korrelierte, vermutlich aufgrund der höheren Expression des Onkogens NPM-ALK. Interessanterweise entwickelten sich die T-Zell-Lymphome bevorzugt in den Lymphknoten der linken Körperhälfte, sowie in der Milz. Die biolumineszente Signalintensität der transduzierten Zellen bei den Kontrolltieren unterlag zeitweise Schwankungen und blieb im Vergleich zur Signalintensität eines Lymphoms um ein Vielfaches schwächer. In der vorliegenden Arbeit gelang es zum ersten Mal, die Entstehung eines NPM-ALK-positiven Lymphoms über Biolumineszenzbildgebung zu visualisieren. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die induzierten ALK-positiven Lymphome mit dem humanen ALK-positiven ALCL zu vergleichen. Die Tumore wurden hinsichtlich ihrer Morphologie, ihres Metastasierungsverhaltens und ihres Immunophänotyps histologisch untersucht. Hierbei konnten vielfältige Ähnlichkeiten des ALK-positiven Lymphoms der Versuchsmäuse, mit der kleinzelligen Variante des humanen ALK-positiven ALCL aufgezeigt werden. In the presented study we tracked tumorigenesis of ALK-positive T-cell lymphoma and elucidated the population dynamics of transplanted mature TCR monoclonal T cells in vivo by using bioluminescence imaging. Also, we compared experimentally induced ALK-positive lymphoma of mice with human ALK-positive ALCL.For this purpose we utilized bicistronic retroviral vectors encoding for the control gene T-Sapphire (fluorescent protein) or the oncogene NPM-ALK, in combination with the marker gene Luciferase for in vivo imaging. We transduced TCR-transgenic OT-1 donor T cells by gammaretroviral gene transfer and transplanted them into Rag-1 deficient recipients. Seven weeks after transplantation the bioluminescent radiance was examined weekly. Additionally, we draw blood every 2 weeks to keep track of the repopulation of the transplanted T cells. Hereby, we were able to monitor the transplanted T cells within the living animals for up to 24 weeks. We could show that the transplanted T cells successfully repopulated lymphopenic recipients within a few weeks. Furthermore, we were able to show that the transplanted TCR monoclonal T cells preferentially colonized the abdominal lymph nodes as well as the spleen. Outside the abdomen the T cells preferred to repopulate the left inguinal lymph node. The tumorigenesis of ALK-positive lymphoma was also traced in vivo. We noticed that the latency of the development of lymphoma might has correlated with the transduction efficacy. Interestingly, the primary tumors rose in the left inguinal lymph node as well as in the spleen. The radiance intensity frequently oscillated during the period of measurement. Moreover, the radiance intensity of the lymphoma cells was significantly higher than the signal intensity of T cells in the control group. Another aim of this study was to compare the artificially generated ALK-positive lymphoma in our laboratory mice with the human ALK-positive ALCL. We analyzed the tumors for their morphology, biological behavior and their immunophenotype. Finally, we were able to identify various similarities between the ALK-positive lymphomas in our experimental mice and the small cell variant of the human ALCL.