Untersuchung von mesenchymalen Stromazellen entnommen aus narkotisierten und euthanasierten Pferden

Abstract

Die Punktion des Sternums stellt eine ergiebige, leicht durchführbare und die in den Kliniken am häufigsten genutzte Methode der Knochenmarksgewinnung dar. In der vorliegenden Arbeit wird neben der Anzucht von MSC aus KM von narkotisierten Pferden erstmals die erfolgreiche Isolation und Anzucht von MSC aus KM von euthanasierten Pferden beschrieben. Bis mindestens 30 Minuten nach der Euthanasie war es in allen Fällen möglich, Knochenmark mit vitalen MSC aus euthanasierten Pferden zu gewinnen. Für die Charakterisierung der MSC wurden kommerziell erhältliche Oberflächenmarker verwendet, mit denen eine Immunophenotypisierung mittels Durchflusszytometrie möglich war. Durch Vorversuche mit 28 vielversprechenden Antikörpern zur Immunophenotypisierung von Stammzellen, konnte ein Marker-Panel von vier Positiv- und zwei Negativmarkern mit Funktionalität auf eMSC zusammengestellt werden. Des Weiteren wurde die Multipotenz der Zellen anhand von adipogener, chondrogener und osteogener Differenzierung nachgewiesen, sowie die Proliferationsfähigkeit unter Standardbedingungen gezeigt. Darüber hinaus wurde ein neuartiges Proliferationsassay etabliert, welches die Möglichkeit bietet, verschieden schnell proliferierende MSC-Populationen zu unterscheiden und damit den Weg zu einer Selektion besonders gut proliferierender Zellen bereitet.Mit den angewandten Verfahren konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Stammzelleigenschaften von MSC aus narkotisierten und aus euthanasierten Pferden ermittelt werden: Beide Gruppen ließen sich chondrogen, adipogen und osteogen differenzieren, zeigten sich plastikadherent und proliferativ und exprimierten das ausgewählte Oberflächenmarkerprofil: Sie zeigten positive Reaktionen für die Marker CD44, CD90, MHCI und CD105 und negative für CD11a/CD18 und MHCII. Aufgrund der Abwesenheit von MHCII auf den Zellen, liegt die Vermutung nahe, dass sie sich auch für eine allogene Transplantation eignen.Die Ergebnisse dieser Arbeit sind vielversprechend für die Etablierung der allogenen Stammzelltherapie mit MSC aus Knochenmark. Für den zukünftigen Einsatz in der Pferdemedizin bedarf es allerdings noch weiterer Studien, beispielsweise zum Einfluss der angewandten Pharmaka bei den euthanasierten Pferden auf die Qualität der MSC, und In-Vivo-Studien zur Verträglichkeit von allogenen MSC. Damit könnte der Weg bereitet werden, die allogene Stammzelltherapie zukünftig als sichere Therapiemethoden im Bereich des Tissue Engineering in der Pferdemedizin etablieren zu können. The puncture of the sternum is an effective, easy performable and the mainly used method in clinics to gain bone marrow. Beside the culturing from MSC from bone marrow of narcotized horses in this research study the successful isolation and culturing of MSC from bone marrow of euthanised horses is described for the first time. Up to 30 minutes after euthanasia it was possible in all cases to gain bone marrow containing vital MSC from euthanized horses. For the characterization of the MSC commercial available surface markers were used, which were suitable for immunophenotyping by flow cytometry. With pilot tests using 28 promising antibodies for the immunophenotypisation of stem cells, a marker panel of four positive- and two negative-markers with functionality on equine MSC could be assorted. Furthermore the multipotency of the cells was demonstrated by adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiations and the ability for proliferation under standard conditions was shown. In addition a new proliferation assay was established, which gives the possibility to discriminate between MSC populations with different proliferation speeds and therefore pioneers a selection for especially good proliferating cells. With the used technics no significant differences between the stem cell characteristics of MSC from narcotized or euthanized horses could be determined: Both groups showed the potential for chondrogenic, adipogenic and osteogenic differentiation, were plastic adherent and proliferative and expressed the selected surface marker profile: They showed positive reactions for the markers CD44, CD90, MHCI and CD105 and negative reactions for CD11a/CD18 and MHCII. Because of the absence of MHCII on the cells it seems likely to guess, that they are also suitable for allogeneic transplantations.The results of this study are promising to establish the allogeneic stem cell therapy using MSC in horse therapy in future. But there is a need for further studies for example about the influence of the used drugs in the euthanized horses and the quality of the harvested MSC and in vivo studies for the compatibility of allogeneic MSC. With these researches the establishment of the allogeneic stem cell therapy as a prospectively safe practical technic of tissue engineering in horse medicine could be pioneered.