Untersuchungen zur vertikalen Übertragung des Parrot Bornavirus bei Psittaziden

Abstract

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur vertikalen Übertragung des PaBV bei Nymphensittichen (Nymphicus hollandicus) durchgeführt. Um die Infizierbarkeit von embryonalen Nymphensittichzellen zu überprüfen, wurden in vitro embryonale Nymphensittichgehirnzellkulturen (NEB) und embryonale Nymphensittichfibroblastenzellkulturen (NEF) von zehn Tage alten Nymphensittichembryonen hergestellt und mit PaBV-4 (Ps34) oder PaBV-2 (Ps39) beimpft und die Wachstumseigenschaften zu untersuchen. Beide Varianten ließen sich auf den NEB- nicht aber auf den NEF-Zellen vermehren. PaBV-2 zeigte hier ein deutlich besseres Wachstum im Vergleich zu CEC-32-Zellen aus Vorversuchen. In einem Vorversuch wurde 3 %iges Wasserstoffperoxid als ein geeignetes Desinfektionsmittel gegen PaBV auf der Eischale bestimmt. In Versuch 1 wurden 32 befruchtete Eier zwischen dem dritten und fünften Bebrü-tungstag mit PaBV-4 in den Dottersack inokuliert und bis zum Tag 12-14 p.i. bebrütet Die Organe jedes Embryos wurden anschließend mittels RT-PCR, Histologie, Immunhistochemie und Virus-Isolierung untersucht. Neun Embryonen wiesen PaBV-4 RNA im Gehirn auf. Bei 26/32 konnte PaBV-Antigen im Gehirn nachgewiesen werden. Keiner der Embryonen zeigte pathologische Veränderungen in der Histologie. Eine Virusisolierung gelang nicht. Anschließend wurden Embryonen an Tag drei bis fünf der Bebrütung in den Dotter-sack (Gruppe 1: n = 25 + 2-Mock-Kontrollen, mit PaBV-4; Gruppe 3: n = 15 + 2-Mock-Kontrollen, mit PaBV-2) beziehungsweise am Tag fünf bis sieben auf die Chorioallantoismembran (Gruppe 2: n = 25 + 2-Mock-Kontrollen, PaBV-4; Gruppe 4: n = 15 + 2-Mock-Kontrollen, mit PaBV-2) inokuliert. In Gruppe 1 und 2 wurden jeweils zehn und in Gruppe 3 und 4 jeweils fünf inokulierte Embryonen und eine Mock-Kontrolle mittels RT-PCR untersucht. Zehn (Gruppe 1 und 2), beziehungsweise fünf (Gruppe 3 und 4) weitere Embryonen je Gruppe wurden histologisch und immunhistochemisch untersucht. Jeweils fünf Embryonen aus allen Gruppen sowie jeweils eine Mock-Kontrolle wurden für die Virus-Isolierung verwendet.Bei acht der zehn infizierten Embryonen (Gruppe 1), 8/10 der Gruppe 2, 4/5 der Gruppe 3 und 5/5 der Gruppe 4 konnte PaBV-RNA im Gehirn nachgewiesen wer-den. 9/10 Embryonen der Gruppe 1, 10/10 der Gruppe 2, 5/5 der Gruppe 3 und 5/5 der Gruppe 4 wiesen PaBV-Antigen im Gehirn nicht jedoch in den Organen auf. Alle Kontrollen waren negativ.In allen Gruppen war eine präferierte Verteilung von PaBV-Antigen im Kleinhirn (Arbor vitae) und Gehirnarealen mit Ventrikelanschnitt, gegenüber dem Großhirn zentral ohne Ventrikelanschnitt zu sehen. Eine genaue Differenzierung der infizierten Zellen mittels verschiedenen Zellmarkern gelang bislang nicht.Histologisch konnten in keinem Embryo pathologische Veränderungen gefunden werden. Aus keinem der inokulierten Embryonen und aus den Kontrolltieren gelang eine PaBV-Isolierung.Die Untersuchung von Eiern von natürlich PaBV infizierten Pyrrhura spp. verlief negativ. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine vertikale Übertragung von PaBV grundsätzlich möglich scheint, wenn PaBV-RNA auf natürlichem Weg ins Ei gelangt. Anhand eines kontrollierten Infektionsversuchs wurde erstmalig gezeigt, dass PaBV nur im Gehirn der Embryos vorkommt. Die fehlende Pathologie in der Histologie deutet auf die Möglichkeit latent infizierter Träger oder einen abortivem Infektionsverlauf hin, welches durch weitere Untersu-chungen geklärt werden muss. In this work vertical transmission of PaBV was investigated in cockatiels (Nymphicus hollandicus). To examine possible infectivity of embryonic cockatiel cells, in vitro em-bryonic cockatiel brain-cell cultures (NEB) and embryonic cockatiel fibroblast cell culture (NEF) of 10 days old cockatiel-embryos were established. These cells were inoculated with PaBV-4 (Ps34) or PaBV-2 (Ps39). Both PaBV-isolates were propagated on NEB but not on NEF cells. In contrast to the results of previous studies, PaBV-2 showed a significantly larger growth in comparison to the CEC-32 cells.In a preliminary test a 3% hydrogen peroxide was determined as an appropriate dis-infectant for the egg shell against PaBV.In study one 32 fertilized eggs were inoculated with PaBV-4 into the yolk sac be-tween the third and the fifth day of incubation and incubated until days 12-14 p.i.. The organs of the embryos were examined with RT-PCR, histology, immunohistochemistry and virus-isolation. Nine embryos demonstrated PaBV-4 RNA and 26/32 PaBV-antigen in the brain. None of the embryos showed pathological signs in the histology. Virus-isolation was not possible. Subsequently embryos were inoculated in the yolk sac (group 1: n = 25 + 2-Mock-controls, with PaBV-4; group 3: n = 15 + 2-Mock-controls, with PaBV-2) on day three to five and on the chorioallontoismembrane (group 2: n = 25 + 2-Mock-controls, with PaBV-4; group 4: n = 15 + 2-Mock-controls, with PaBV-2) on day five to seven of in-cubation. In each of group 1 and 2, ten and in group 3 and 4 five inoculated embryos and one control were examined through RT-PCR. Furthermore ten embryos each (group 1 and 2) and five embryos each (group 3 and 4) were histologically and immunohistochemically examined. Of each of the four groups five embryos as well as one Mock-control were used for virus-isolation. In eight out of ten infected embryos (group 1), 8/10 of group 2, 4/4 of group 3 and 5/5 of group 4 PaBV-RNA was detected in the brain. 9/10 infected embryos of group 1, 10/10 of group 2, 5/5 of group 3 and 5/5 of group 4 showed PaBV-antigen in the brain but not in the organs. All controls remained negative. All groups showed a preferred allocation of PaBV-antigen in the cerebellum (Arbor vitae) and in brain areas with ventricels in comparison to the central large cerebrum without ventricels. So far, there was no success in differentiating the infected cells with various cell markers.There were no pathological alterations of any embryo in the histological examination. It was not possible to isolate PaBV from any of the inoculated embryos nor of the control group.The examination of eggs of Pyrrhua spp., which were naturally infected with PaBV, remained negative. The results of these studies underline, that vertical transmission may be possible if PaBV-RNA can naturally be transferred into the egg. In the present study it was demonstrated for the first time, that PaBV is only found in the brain of the infected embryos. The absence of histopathological alterations in the infected embryos can be inter-preted as the possibility of latent infected birds or maybe the virus infection was abortive. Further investigations into these questions are recommended.