Untersuchungen zur Transkription von Wachstumsfaktoren und Zytokinen an felinen Vakzinationsstellen-assoziierten Sarkomen in vivo und in vitro

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden 5 feline Vakzinationsstellen-assoziierte Sarkome (VAS)sowie aus diesen gewonnene Zelllinien charakterisiert und auf die Transkription solcherWachstumsfaktoren und Zytokine untersucht, die in Zusammenhang mit Entzündungen eineRolle spielen. Es handelte sich um ein gut differenziertes VAS, ein mittelmäßigdifferenziertes VAS und drei schlecht differenzierte VAS, eins davon mit osteoiden Anteilen.Alle VAS enthielten á-SMA-exprimierende Zellen sowie mehrkernige Riesenzellen. Bei denRiesenzellen gab es sowohl Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-positive als auchTRAP-negative, was in Zusammenhang mit Literaturergebnissen zur Proliferationsaktivitätvermuten lässt, dass verschiedene Typen von mehrkernigen Riesenzellen in VAS existieren:fusionierte Makrophagen sowie mehrkernige Tumorzellen, entstanden durch Zellfusion oderEndomitose. Von allen VAS konnten permanente Zelllinien etabliert werden, derenCharakteristika mit den Primärtumoren vergleichbar waren. Insgesamt war die Expressionvon MHC II in den Zellinien vermindert. Alle Zelllinien enthielten mehrkernige Riesenzellen,deren Kernanzahl mit Ausnahme von L1 weit geringer war als die der Riesenzellen in denPrimärtumoren. L1 enthielt Riesenzellen mit mehr Kernen als der Primärtumor T1. AlleRiesenzellen in Kultur waren TRAP-negativ, was dafür spricht, dass es sich um neoplastischeZellen handelte. Kollagenproduktion konnte nur in einer Linie nachgewiesen werden, die voneinem schlecht differenzierten Primärtumor stammte. Nur eine der drei Linien, die vonschlecht differenzierten VAS stammten, zeigte auch in Kultur ein eher undifferenziertesErscheinungsbild, die anderen zeigten sowohl in Bezug auf die Zellmorphologie als auch aufdas Wachstumsverhalten ein gut differenziertes Erscheinungsbild.Die Chromosomenanalyse ergab eine breite Streuung: Es wurden sowohl eine Hypoploidievon 23 bis 36 Chromosomen als auch eine Hyperploidie von 60 bis 158 Chromosomengefunden. Alle Linien wiesen eine durchschnittlich deutlich erhöhte Chromosomenzahl miteinem Median von 46 bis 62 Chromosomen auf. Es konnte keine spezielle Vervielfachungeines bestimmten Chromosoms oder des gesamten Chromosomensatzes beobachtet werden.L2 war durch ein Markerchromosom gekennzeichnet: Bei Chromosom 1 trat häufig eineachromatische Region auf. Die Bedeutung dieses Markerchromosoms bedarf weitererUntersuchungen.Für die Untersuchung der Transkription von EGF, FGF-2, PDGF, TGFbeta1, TNF und IL-1wurde die komparative CT-Methode mit GAPDH als houskeeping Gen verwendet, da dieEffizienzen aller Primer-Sonden-Systeme zwischen 90 % und 100 % betrugen. Mit dieserMethode konnte keine Transkriptionserhöhung für EGF, FGF-2 und PDGF nachgewiesenwerden. Eine deutliche Transkriptionserhöhung konnte dafür bei TGFbeta1, TNF und IL-1festgestellt werden. TGFbeta1 schien sowohl von Tumorzellen selbst als auch vonEntzündungszellen transkribiert zu werden. Die Bedeutung dieses Wachstumsfaktors für VASkönnten in seiner wachstumsfördernen Wirkung, der Induktion von alpha-SMA und der immunsuppressiven Wirkung liegen. Demgegenüber scheinen TNF und IL-1 in VAS fastausschließlich von Entzündungszellen und nicht von den Tumorzellen selbst transkribiert zuwerden. Diese proinflammatorischen Zytokine können synergistisch eine Förderung vonWachstum, Angiogenese und Invasion bewirken. Dafür, dass TNF in VAS tumorsuppressiveWirkungen entfaltet, gab es keine Hinweise. Er scheint aber die Kollagenproduktion in VASzu fördern. In this study 5 feline vaccine-associated sarcomas (VAS) and their derived cell lines werecharacterized and investigated for transcription of growth factors and cytokines that play arole in the process of inflammation. The VAS comprised one well differentiated, onemoderately differentiated and three poorly differentiated VAS; one of the latter containingisles of osteoid. All VAS displayed alpha-SMA-producing cells as well as multinucleated giantcells. Multinucleated giant cells were either tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive or TRAP-negative. These results in combination with studies on proliferation activitydescribed in literature lead to the conclusion that different types of multinucleated giant cellsexist in VAS: fused macrophages and multinucleated tumor cells, formed by cell fusion orendomitosis.Permanent cell lines displaying characteristics similar to those of the primary tumors,including expression of alpha-SMA, could be established from all VAS. Expression of MHC IIwas reduced in cell lines compared with the tumors. All cell lines contained multinucleatedgiant cells with far less nuclei than those of the primary tumors except for L1; this cell lineshowed multinucleated giant cells containing more nuclei than the primary tumor. All giantcells in culture were TRAP-negative, which leads to the conclusion that their nature wasneoplastic. Only one cell line produced collagen. This line was derived from a poorlydifferentiated primary tumor. Only one cell line originating from a poorly differentiated VASalso displayed undifferentiated growth in culture; the others appeared well differentiated incell morphology as well as in cell growthChromosomal analysis revealed a broad distribution: Hypoploidy ranging from 23 to 36 aswell as hyperploidy from 60 to 158 were seen. All lines displayed chromosomal numbersabove average with means between 46 and 62. No defined multiplication of a specialchromosome or the complete chromosomal set was detected.L2 was characterized by a marker chromosome: Chromosome 1 often showed an achromaticregion. The importance of this finding needs to be further investigated.To measure the transcription of EGF, FGF-2, PDGF, TGFbeta1, TNF and IL-1, the comparativeCT-method with GAPDH as housekeeping gene was used, as the efficiency of all primerprobe-systems were between 90 % and 100 %. With this method, no increase of transcriptionwas detected for EGF, FGF-2 and PDGF. An obvious increase was found in transcription ofTGFbeta1, IL-1 and TNF. Appearently, TGFbeta1 was transcribed by tumor cells as well as byinflammatory cells. Its importance for VAS can lie in its ability to promote growth, induce theproduction of alpha-SMA and to suppress immunoreactions. In contrast to TGFbeta1 being producedin VAS by tumor cells and inflammatory cells, results indicate that IL-1 and TNF are almostsolely transcribed by inflammatory cells. These inflammatory cytokines are able to promotegrowth, angiogenesis and invasion in a synergistic way. No evidence was found for a possibleimmunosuppressive effect of TNF in VAS. Actually, it seems to promote production ofcollagen in VAS.