Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks aus Osteoporose-Modellen der Ratte

Abstract

Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks aus Osteoporose-Modellen der Ratte. Das Ziel dieser Arbeit war es, diese MSC näher zu charakterisieren und anhand der gewonnenen Ergebnisse die untersuchten Osteoporose-Modelle detaillierter zu beschreiben. Die untersuchten MSC entstammten aus Ratten des Teilprojektes T1 Etablierung und Qualitätssicherung osteoporotischer Tiermodelle des Transre-gio 79 Werkstoffe für die Geweberegeneration im systemisch erkrankten Knochen . Diese Arbeit ist Bestandteil des Teilprojektes B4 Einfluss mehrphasiger Knochenersatzstoffe und oberflächenmodifizierter Titanlegierungen auf die Differenzierung von Osteoblasten/MSC . Untersucht wurden MSC aus den Modellen Ovarektomie in Kombination mit einer Calcium-defizitären Diät und Ovarektomie in Kombination mit der Gabe eines Steroids zu den Standzeiten drei und zwölf Monaten im Vergleich zu MSC scheinoperierter Kontroll-Ratten. Die Charakterisierung der isolierten MSC erfolgte hinsichtlich ihrer Morphologie, ihrer Proliferations- und Migrationskapazität sowie hinsichtlich ihres osteogenen und adipogenen Differenzierungsvermögens. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Untersuchungen gewonnen werden: Die Induktionsmethoden OVX + Diät und OVX + Steroid üben einen Einfluss auf die MSC des Knochenmarks aus, wobei sich die unterschiedlichen Kombinationen unterschiedlich stark auswirken. Durch die Kombina-tion der Ovarektomie mit der Gabe einer Calcium-defizitären Diät konnten deutlichere Unterschiede zu MSC der Kontroll-Gruppe Sham gezeigt wer-den als durch die Kombination OVX + Steroid. Die Charakteristika der MSC ändern sich zudem im Laufe der Zeit, das heißt es zeigen sich gegensätzliche Ergebnisse bei Betrachtung der beiden Standzeiten drei und zwölf Monate. Ein Vergleich der gewonnenen Ergebnisse des Tiermodells mit der Erkrankung Osteoporose gestaltet sich aufgrund widersprüchlicher Studien zu humanen MSC osteoporotischer Spender sowie der beschriebenen Limitationen des Tiermodells schwierig. Es konnten zum Teil, auch wiederum abhängig von der betrachteten Standzeit der Ratten, Parallelen zu Studien an humanen MSC festgestellt werden. Weitere Untersuchungen, sowohl an MSC aus Tiermodellen als auch an humanen MSC osteoporotischer Spender sind von Nöten, um die Differenzen zwischen Tiermodell und Mensch genau zu bestimmen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass, insbesondere durch die Induktionsmethode der Ovarektomie in Kombination mit einer Calcium-defizitären Diät die mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks beeinflusst werden. Die MSC zeigen drei Monate nach Beginn der Induktion zunächst einen Phänotyp ähnlich gealterter Stammzellen. Zudem ist das Proliferations- und Migrationsvermögen der MSC vermindert. Die osteogene Differenzierungskapazität hingegen ist erhöht, was möglicherweise Ausdruck der Gegenregulation der MSC gegen den beginnenden Knochenmasseverlust darstellt. Diese Hypothese wird durch die signifikanten Unterschiede in der RUNX2 Expression undifferenzierter Zellen zwischen der Kontroll-Gruppe und der Gruppe OVX + Diät unterstützt (p=0,0058). Das Verhalten der MSC ändert sich mit andauernder Induktion. So zeigen die MSC der ovarektomierten Ratten nach zwölf Monaten Standzeit wiederum ein Proliferations- und Migrationsvermögen ähnlich dem der MSC aus Kontroll-Tieren. Das osteogene Differenzierungsvermögen ist nun hingegen im Vergleich zur Kontroll-Gruppe Sham vermindert. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen der Gruppe OVX + Diät und der Gruppe Sham (p=0,0468) bezüglicher der Osteocalcin-Expression der osteogen differenzierten Zellen. Nach zwölf Monaten Standzeit ist möglicherweise das osteogene Differenzierungsvermögen der MSC in gewisser Weise erschöpft. The aim of this study was the characterization of bone-marrow derived mesen-chymal stem cells in osteoporotic models of the rat.To date the ovariectomized rat has been the most frequently used model of osteo-porosis research. Since this disease occurs only in humans, there is a great need for valuable animal models to facilitate testing of new therapeutic approaches or new prosthetic devices for the osteoporotic bone. However, regarding characterization of bone-marrow derived MSC little information is available elucidating putative cellular changes in the course of osteoporosis induction in the rat model. This work was part of the Collaborative Research Center Transregio 79 Materials for tissue regeneration within systemically altered bone sub-project B4 Influence of multiphase-bone replacement materials and surface-modified titanium alloys on the differentiation of osteoblasts/MSC . The MSC studied were obtained of rats of the sub-project T1 Establishment and quality management of osteoporotic animal models . Induction of osteoporosis in rats was performed by ovariectomy in combination with a calcium-deficient diet and by ovariectomy in combination with a steroid (dexamethasone). Three and twelve months after surgery, MSC were isolated from the bone marrow. Sham-operated groups were established as controls. The harvested MSC were characterized regarding morphology, proliferation- and migration-capacity and their differentiation potential towards the adipogenic and osteogenic lineage. Results indicate that induction of osteoporosis in the rat model by ovariectomy in combination with either a calcium-deficient diet or a steroid has an influence on the MSC residing in the bone marrow.The MSC harvested three months after surgery showed a phenotype of cells in a state of presenescence. Proliferation- and migration rates were diminished pointing to self-renewal deficiency and impaired motility. However, osteogenic differentiation potential was increased after osteoporosis induction. These alterations compared to the control group Sham could be detected in both experimental groups (OVX + Diet and OVX + Steroid). However, the clearest differences compared to the control group could be detected on MSC of the experimental group OVX + Diet. In contrast, MSC harvested twelve months after surgery revealed no clear differences regarding proliferation und migration potential. However, the MSC of the experimental groups OVX + Diet and OVX + Steroid had a diminished osteogenic differentiation potential compared to the control group Sham.Based on the present results, it could be shown that osteoporosis induction in the rat model effects the mesenchymal stem cells in the bone marrow. The characteristics of the MSC change dependent on the osteoporosis inducers administered. Three months after surgery the osteogenic differentiation potential of the MSC of the experimental groups OVX + Diet and OVX + Steroid was increased. Possibly, the up-regulation of osteogenic markers might represent a compensatory mechanism at the cellular level in consequence of the occurring bone loss. The significant differences in the expression of RUNX2 (p = 0,0058) between undifferentiated cells of the control group Sham and OVX + Diet support this hypothesis.Twelve months after surgery, this compensation mechanism might be somehow exhausted since the osteogenic differentiation capacity of the MSC of the experimental groups OVX + Diet and OVX + Steroid was diminished compared to the control group Sham. The differences in the Osteocalcin expression of osteogenic differentiated cells between OVX + Diet and Sham were significant (p = 0,0468).