Vergleichende Untersuchungen zum molekularbiologischen Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in Milch und Säuglingsanfangsnahrung

Abstract

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose bei Wiederkäuern. Aufgrund der typischen pathomorphologischen Veränderungen, die MAP in Rindern und Primaten auslöst, wurde ein möglicher Zusammenhang mit der Entwicklung von Morbus Crohn (MC) vermutet (Chiodini et al., 1989). Dieser wird seit Beginn des 20. Jahrhunderts immer wieder diskutiert. Die Wege, über die MAP zum Menschen gelangen kann, sind vielfältig. Das Überleben geringer Mengen MAP in Milch nach der Pasteurisierung konnte in zahlreichen Studien, unter anderem aus Deutschland (Hammer et al., 2002), gezeigt werden. Ist MAP im Ausgangsmaterial vorhanden, kann es aus dieser Milch hergestellte Produkte kontaminieren (Donaghy et al., 2004). Daher können neben Milch auch Milchprodukte wie Käse, Säuglingsnahrung und Sahne als mögliche Quelle für eine Übertragung von MAP auf den Menschen gesehen werden. Im Hinblick auf die erhöhte Empfänglichkeit von Kälbern für MAP (Windsor und Whittington, 2009) und der noch nicht geklärten Frage des zoonotischen Potentials, ist die Untersuchung von Säuglingsnahrung von besonderem Interesse. Die zuverlässige Diagnose einer Infektion mit MAP stellt das Hauptproblem in der Überwachung der Paratuberkulose dar. Die kulturelle Anzucht wird zwar als Goldstandard für den Nachweis von MAP beschrieben, aufgrund der kurzen Haltbarkeit von Milch und Milchprodukten und der langen Wachstumsdauer des Erregers ist diese unpraktisch für Routinediagnostik und Überwachung (Tasara und Stephan, 2005). Ziel der eigenen Untersuchungen war es, ein Verfahren zur Erfassung von MAP-Zellen in Milch und Säuglingsanfangsnahrung als routinetaugliche Screeningmethode zur Verfügung zu stellen. Die in den eigenen Untersuchungen eingesetzte MAPsureEasy® (MSE) Real Time-PCR (Fa. TransMIT, Gießen) weist die MAP spezifische Zielsequenz f57 nach. Der Vorteil von f57 liegt in seiner strengen Einzigartigkeit (Herthnek und Bölske, 2006), Kreuzreaktionen konnten für f57 nicht nachgewiesen werden (Donaghy et al., 2011). Die DNA-Extraktion erfolgte mit jeweils modifizierten Protokollen für das High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche, Mannheim) und das DNeasy® Blood & Tissue Kit (Fa. Qiagen, Hilden) sowie das automatisierte Maxwell® 16 System(Fa. Promega, Mannheim). Die Nachweisgrenze (Nachweiswahrscheinlichkeit 95%) für artifiziell kontaminierte Rohmilch lag für die einzelnen Verfahren im Bereich von 6,3x102 bis 7,9x102 KbE/10 ml. In Abhängigkeit von der verwendeten Methode lag die Nachweisgrenze bei Säuglingsanfangsnahrung Pre im Bereich von 4,1x100 bzw. 4,7x100 KbE/10 ml. In Säuglingsanfangsnahrung One lag die Nachweisgrenze bei 6,5x101 KbE/10 ml. Kombiniert mit der Real Time-PCR MAPsureEasy® liegt, unabhängig vom gewählten Extraktionsverfahren, das Endergebnis der molekularbiologischen Untersuchung innerhalb eines Arbeitstages vor. Somit kann die MAPsureEasy® Real Time-PCR als Schnellmethode zum Nachweis von MAP eingesetzt werden. Im Anschluss an die Hauptversuche wurde ein repräsentatives Spektrum von Säuglingsanfangsnahrung ( Pre , Pre HA und One ) aus dem deutschen Handel molekularbiologisch auf das Vorkommen von MAP untersucht. In keinem der 24 untersuchten Produkte konnten MAP-DNA nachgewiesen werden. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the pathogen causing paratuberculosis in ruminants. Due to the typical pathomorphological changes in cattle and primates, a possible link to the development of Crohn s Disease (CD) was suspected (Chiodini et al., 1989). Since the beginning of the 20th century this repeatedly is discussed. There are a lot of paths through which MAP can get to humans. The survival of MAP in milk after pasteurisation could be demonstrated in several studies, some of them from Germany (Hammer et al., 2002). If MAP is in the basic raw material, it can contaminate dairy products produced from this (Donaghy et al., 2004). Therefore, in addition to milk also dairy products like cheese, powdered infant milk and cream can be seen as a potential source of transmission from MAP to humans. In view of the increased susceptibility of calves for MAP (Windsor and Whittington, 2009) and the unsolved question of the zoonotic potential, the investigation of powdered infant milk is of particular interest. The reliable diagnosis of an infection with MAP represents the main problem in the monitoring of paratuberculosis. Cultivation is described as goldstandard for the detection of MAP. However due to the short shelf life of milk and dairy products as well as the long growth duration of MAP it is impractical for routine diagnostic and monitoring (Tasara und Stephan, 2005). The aim of the investigations was to validate a method for the detection of MAP cells in milk and powdered infant formula which can be used for screening. In the investigations the MAPsureEasy® (MSE) real time-PCR (Ltd. TransMIT, Gießen) is used, based on the MAP-specific marker f57. The advantage of f57 is its strict uniqueness (Herthnek und Bölske, 2006); cross-reactions were not detected for f57 (Donaghy et al., 2011). The DNA extraction was accomplished with each modified protocols for the High Pure PCR Template Preparation Kit (Ltd. Roche, Mannheim) and the DNeasy ® Blood & Tissue Kit (Ltd. Qiagen, Hilden) as well for the automated Maxwell® 16 System (Ltd. Promega, Mannheim). The detection limit (detection probability of 95%) was for artificially contaminated raw milk for each method in the range of 6.3x102 to 7.9x102 CFU/10 ml. Depending on the method used, the detection limit of powdered infant formulas "Pre" was in the range of 4.1x100 or 4.7x100 CFU/10 ml. In powdered infant formula "One" the detection limit was 6.5x101 CFU/10 ml. Combined with the real time-PCR MAPsureEasy®, regardless of method used for DNA extraction, the final result of the molecular-based method is available within one working day. Thus, the MAPsureEasy® real time-PCR may be used as a rapid detection method for MAP.Following the described investigations, a representative spectrum of powdered infant formulas ("Pre", "Pre HA" and "One") at the german retail level was examined molecular-based assay* for the presence of MAP. In none of the 24 examined products MAP-DNA could be detected.