Untersuchungen zur Erfassung und Verbesserung der Fruchtbarkeitslage in Rinderbetrieben : Etablierung eines Verfahrens zur Bestimmung der Konzentrationen des Pregnancy Associated Glycoproteins im Blut zur Trächtigkeitsdiagnostik und Erfassung der embryonalen Mortalität

Abstract

Ziel vorliegender Arbeit war es, zwei Radioimmunoassays (RIAs) zur Bestimmung von Pregnancy Associated Glycoproteins (PAGs) im Blutplasma von Rindern zur frühen Trächtigkeitsdiagnose zu etablieren und diese auf ihre Aussagekraft und Praktikabilität unter den hier gegebenen Bedingungen zu überprüfen. Gleichzeitig sollten weitere Erkenntnisse zum spätembryonalen Fruchttod sowie zur korrekten Wahl des Besamungs(KB)-Zeitpunktes erhalten werden, letzteres anhand der Messung von Progesteron.Bei den beiden PAG-RIAs handelte es sich um boPAG1-RIA497 (RIA497) und boPAG1-RIA706 (RIA706). Bei ihnen konkurrieren bovines PAG (boPAG) aus der Probe/Standard mit 125J markiertem boPAG1 (boPAG1-Tracer) um Bindungsstellen an polyklonalen Antikörpern, die bei RIA497 gegen boPAG1 und bei RIA706 gegen caprines PAG(caPAG)55+62 kDa gerichtet sind. RIA497 wird im Labor Beckers (Liege, Belgien) routinemäßig durchgeführt (Zoli et al. 1992b); mit RIA706 liegen bisher nur wenige Erfahrungen vor. Die für die Etablierung der Methodik notwendigen spezifischen Reagenzien wurden vom Labor Beckers gestellt.Unbeschadet der dort erfolgten ersten Einarbeitung der Autorin ergaben sich erhebliche Probleme bei der Einrichtung der beiden RIAs, die sich in einer unbefriedigenden Bindung des boPAG1-Tracers an die beiden Antikörper zeigten. In den dazu durchgeführten Untersuchungen konnte das Problem nicht abschließend gelöst werden. Die beiden RIAs erfüllten nur für die Messungen der Proben aus den Tierkollektiven 1 und 2 (TK 1 und TK 2) die analytischen Qualitätskriterien, bei Messung der Proben aus Tierkollektiv 3 (TK 3) ist aufgrund der sehr geringen Bindung des boPAG1-Tracers von einer Überschätzung der gemessenen PAG-Werte auszugehen, die qualitative Aussage ist jedoch als richtig zu bezeichnen.Die Untersuchungen erfolgten an drei Tierkollektiven. TK 3 (n = 7) diente zur Erfassung des Verlaufs der PAG-Konzentrationen während der Trächtigkeit, bei den Tieren aus TK 2 (n = 197, Klein- und Mittelbetriebe) und TK 1 (n = 296, Großbetriebe) sollte die Anwendbarkeit der beiden RIAs zur laborgestützten Graviditätsdiagnostik überprüft werden. Dazu wurden die PAG-Konzentrationen am Tag der KB (1. Beprobung) sowie 29 31 Tage danach (2. Beprobung) gemessen. Die 2. Beprobung diente zur Diagnose tragend / nicht tragend und wurde in TK 1 mit dem Ergebnis einer transrektalen Ultraschalluntersuchung (TRUS) zum selben Zeitpunkt, in TK 2 mit einer später durchgeführten transrektalen Palpation überprüft. Zur Feststellung embryonaler Mortalität erfolgte eine 3. Beprobung 39 53 Tage nach der KB bei zum Zeitpunkt der 2. Beprobung als tragend eingestuften Tieren.Da einige Kühe des TK 1 sehr früh nach der Kalbung besamt worden waren und zu erwarten war, dass zum Zeitpunkt der 2. Beprobung noch Rest-PAG aus der letzten Trächtigkeit die Testergebnisse verfälscht, wurden die Tiere in Abhängigkeit von dem zu erwartenden Rest-PAG-Gehalt in die Gruppen A (kein Rest-PAG), B (möglicherweise Rest-PAG) und C (Rest-PAG vorhanden) eingeteilt.Bei den trächtigen Tieren des TK 3 entsprach der Verlauf der PAG-Konzentrationen den Erwartungen, wobei die mit RIA706 erhaltenen Werte generell höher lagen als die mit RIA497 gemessenen Konzentrationen.Trotz Nachweis von Rest-PAG in Gruppe C konnte in allen Gruppen des TK 1 ein signifikanter Unterschied in der PAG-Konzentration zwischen den mittels TRUS als tragend und als nicht tragend diagnostizierten Tieren festgestellt werden. Zur Charakterisierung der Zuverlässigkeit beider RIAs hinsichtlich ihrer Anwendung als Trächtigkeitsdiagnostikverfahren wurde mithilfe einer ROC-Analyse der Grenzwert (cut off-Punkt) ermittelt, bei dem die höchstmögliche Anzahl von Tieren vom Test als korrekt tragend (Sensitivität) bzw. korrekt nicht tragend (Spezifität) erkannt wurde. Beide RIAs stellten sich mit einer Sensitivität von 93,9 (RIA497) bzw. 92,9 % (RIA706) und einer Spezifität von 85,3 (RIA497) bzw. 94,1 % (RIA706) als in dieser Hinsicht zuverlässig heraus (TK 1), wobei RIA706 aufgrund der allgemein höheren Spezifität für die frühe Trächtigkeitsdiagnose geeigneter erscheint als RIA497. Ein Ausschluss der Kühe der Gruppe C (KB 40. 60. Tag post partum) hatte insbesondere bei RIA706 nur einen sehr geringen bzw. praktisch keinen Einfluss auf Sensitivität bzw. Spezifität. Das Ergebnis bestätigte sich bei Einbeziehung von TK 2 in die Berechnungen. Die Progesteron-Bestimmung zum Zeitpunkt der KB zeigte, dass 6,9 bzw. 10,9 % der Tiere in TK 1 bzw. TK 2 nicht zum korrekten Zeitpunkt zur KB vorgestellt worden waren. Spätembryonale Mortalität konnte bei 7 % der Tiere des TK 1 festgestellt werden, bei einem Tier des TK 3 konnte Fruchttod anhand des PAG-Konzentrationsverlaufs dokumentiert werden.Die durchgeführten Untersuchungen lassen das hohe Potential der PAG-Analytik für die Graviditätsdiagnostik erkennen. Die bei Etablierung der beiden RIAs auftretenden methodischen Probleme stehen einer routinemäßigen Anwendung jedoch entgegen. Aim of the present study was to establish two Pregnancy Associated Glycoprotein-radioimmunoassays (PAG-RIAs) for early pregnancy diagnosis in cattle and to evaluate their reliability and practicability under local field conditions. In addition it was attempted to obtain information on embryonic mortality and, by determing progesterone, the correct choice of the day of artificial insemination (AI).In both RIAs bovine PAG (boPAG) in the sample or standard compete with 125J labelled boPAG1 (boPAG1-tracer) for binding sites of a polyclonal antibody. In boPAG1-RIA497 (RIA497) the antiserum is directed against boPAG1, in boPAG1- RIA706 (RIA706) against caprine PAG (caPAG)55+62 kDa. While RIA497 is routinely performed by the laboratory Beckers (Liege, Belgium), using the method Zoli et al. (1992b), only little experience has been gained so far with RIA706. To establish the two RIAs the essential reagents (antisera 497 and 706, boPAG1) were provided by the laboratory Beckers. Irrespectively of the training given in the laboratory Beckers, problems associated with the binding of boPAG1-tracer with the two antisera became apparent. The problem could only partially be solved and analytical reliability could only be secured for the analysis of samples from collectives 1 and 2, while the data obtained for collective 3 are less quantitative but qualitative. Investigations were performed on three animal collectives. Collective 3 (n = 7) was used to observe PAG-concentrations throughout pregnancy, collective 2 (n = 197, small farms) and collective 1 (n = 296, large farms) were used, to test for the aptitude and reliability of the two RIAs for diagnosing early pregnancy.The first sample was taken on the day of AI, the second sample 29 to 31 days later. PAG-concentrations measured in the second sample were used as parameters for pregnancy diagnosis. Transrectal ultrasonography (TRUS) at the time of blood sampling (collective 1) or transrectal palpation at a later point of time (collective 2) were used as confirmatory methods. To assess embryonic mortality a third sample was collected 39 53 days after AI from those animals found pregnant at the second sampling.As insemination of cows from collective 1 started very early after calving (from day 40 post partum onward), it was assumed that PAGs from the preceding pregnancy could distort pregnancy diagnosis. According to the PAG-concentration expected at the second sampling, cows were assigned to the following groups: A (no residual PAG), B (residual PAG likely), C (residual PAG).PAG-concentrations in collective 3 were as expected: Increasing concentrations were detectable by both RIAs, and invariably higher concentrations were measured throughout pregnancy by RIA706.In spite of the residual PAG detected in cows of group C there were significant differences in PAG-concentration between cows diagnosed pregnant and non pregnant by TRUS.To characterize both RIAs concerning the ability to differentiate between pregnant and non pregnant animals, the cut off-value with the highest rate of correct pregnant (sensitivity) and correct non pregnant animals (specifity) was calculated by Receiver Operating Characteristic(ROC)-analysis.Both RIAs proved to be reliable concerning early pregnancy diagnosis (RIA497: sensitivity 93.9 %, specifity 85.3 %; RIA706 sensitivity 92.9 %, specifity 94.1 %).RIA706 proved to be more suitable for pregnancy diagnosis than RIA497 because of higher specifity. Excluding group C (AI between 40 60 days after calving) from calculation did hardly influence sensitivity and specifity. These results were confirmed by including collective 2 in the statistics.Late embryonic mortality was detectable in 7 % of the cattle in collective 1 and could be documented in one cow of collective 3.Measuring progesterone on the day of AI illustrated that 6.9 % respectively 10.9 % of the animals of collective 1 and 2 were inseminated at an inadequate point of time. These data show the high potential of analyzing PAG for early pregnancy diagnosis, but the methodical problems that appeared militate against applying both tests routinely in this laboratory.