The bovine placenta as a source and target of steroid hormones : aspects on the role of androgens and sulfonated steroids

Abstract

As a temporary endocrine organ, the placenta is capable of synthesizing and secreting a broad range of hormones and other bioactive molecules. Like in many other mammalian species, also in cattle the placenta exhibits a considerable steroidogenic activity with estrone sulfate (E1S) and progesterone being the main products from a quantitative point of view. However, the biological role of placental steroidogenesis in cattle is widely unclear as the placenta contributes only negligibly and temporarily to peripheral maternal progesterone blood levels, and the main estrogenic product E1S does not interact with classical nuclear estrogen receptors. Based on the observation that receptors for progesterone and estrogens are expressed in bovine placentomes the concept of placental steroids as local regulators of placental growth, differentiation and functions has been put forward. However, data from functional studies to corroborate this concept are not yet available, and apart from the functions of bovine placental steroids, there are still many open questions concerning synthesis and transport especially of sulfonated estrogens in cattle. Thus, this study focuses on three aspects of bovine placental steroidogenesis: 1) the expression of the estrogen-specific sulfotransferase (SULT1E1) to identify the sites of estrogen sulfonation in the pregnant cow 2) to further characterize the expression of the sodium-dependent organic anion transporter (SOAT; syn.: SLC10A6) which is considered as a putatively relevant transporter of estrogen sulfates 3) to test for the possibility that steroids other than progesterone and estrogens e.g. androgens - are functionally important products of bovine placental steroidogenesis.In order to localize SULT1E1 in bovine placentomes on a cellular level and to assess its expression quantitatively throughout gestation, immunocytochemical and real-time RT-PCR methods were established, respectively. In immunocytochemisty (ICC) two different primary antibodies were applied: a rabbit antiserum against bovine recombinant SULT1E1 (generously provided by Dr. R. Sullivan, Centre de Recherche en Biologie de la Reproduction and Departement d Obstetrique-Gynecologie, Faculte de Médecine, Université Laval, Quebec, Canada) and a commercial murine antiserum against the human enzyme. Specificity of these antibodies was confirmed in western blot. They yielded virtually identical results in ICC. Different from previous data published in the literature based on ICC and in situ hybridization, where SULT1E1 in bovine placentomes was localized in trophoblast giant cells (TGC), strong specific cytoplasmic staining was only found in uninucleated trophoblast cells (UTC) and SULT1E1 was rapidly down-regulated when trophoblast cells showed characteristics of TGC differentiation. Throughout gestation, distinct immunostaining for SULT1E1 was found in UTC of the chorionic plate. A gradient of staining intensity was observed along the chorionic villous tree with a decrease of mean staining intensities between the basal parts of stem villi and the tertiary villi. With real-time RT-PCR, in the course of pregnancy a significant increase of SULT1E1-mRNA expression was found in the last trimester and at parturition (p=0.0043), which confirms earlier studies by other investigators. Consistent with the increase of SULT1E1-mRNA in real-time RT-PCR in immunohistochemistry an increase of overall staining intensity was detected during late gestation and at parturition with the antiserum against bovine SULT1E1 but this was not obvious with the antiserum against the human enzyme. Moreover, with the antiserum against the bovine enzyme a weak cytoplasmic signal was obtained in the caruncular epithelium in a part of placental samples in addition to the distinct signals in UTC. When screening bovine organs for SULT1E1-mRNA expression by real-time RT-PCR, highest levels were found in the placenta (2851 relative units, RU; day 272), followed by fetal liver (day 185: 748 RU; day 210: 816 RU). In adult bovine organs, SULT1E1 expression was clearly lower with highest levels in adrenal (144 RU) and skin (91 RU) and was only minimal in the remaining organs investigated including liver (21 RU).The results give strong evidence that different from results of earlier studies the main sites of SULT1E1 expression in bovine placentomes are the UTC and not the TGC. They suggest that SULT1E1 may protect UTC from the high levels of free estrogens produced by TGC and it may be involved in the control of TGC differentiation.The aim of the second part of this study was to further characterize the expression of the five isoforms identified so far of the SOAT in the bovine placentome and other organs. The SOAT standard form (variant 1) cloned from bovine placentome has been recently shown in vitro to efficiently mediate the cellular import of E1S and thus may be a physiologically relevant transporter for the large amount of E1S produced in the trophoblast during bovine gestation. Virtually no information was available so far on the expression pattern and functions of the remaining four isoforms. Variant-specific conventional RT-PCR methods could be established for all of the five variants. With these methods, placental tissue samples from different stages of gestation were screened for SOAT isoform expression. For comparison, a broad spectrum of other tissues and organs was also included into the study. Specific amplicons were obtained in all (variants 1, 2, 5) or most (variant 3) of the tissue samples. For variant 4, bands were only weak or absent in a considerable proportion of placental or adult tissue samples. Real-time RT-PCR methods (SYBR green) could be established for variants 1, 2, 3 and 5. Expression of all these variants did not change significantly in bovine placentomes during early and midgestation but was more than 10 fold higher in the maternal part of placentomes from cows at normal term suggesting that their expression is up-regulated in the prepartal period. When screening various bovine organs quantitatively for expression of mRNA specific for SOAT isoforms, for variants 1, 2 and 5 expression in testis (1253 RU, 8195 RU, 4575 RU, resp.) exceeded by far expression measured in other organs or tissues. Other significant sites of SOAT-variant 1 expression are skin (734 RU), udder (282 RU) and colon (255). Besides in the testis, variant 2 was significantly expressed in the skin (1410). Highest expression for variant 3 was also found in the testes (158 RU), which however- was only slightly higher than in the ovarian stroma (113 RU). The spectrum of measurable SOAT isoforms varied considerable between tissues and organs with testis, placenta and corpus luteum being the only organs where all four isoforms assessed were expressed in measurable levels. Expression levels in placentome for variants 1 (5.3 RU), 2 (31.8 RU), 3 (2.5 RU) and 5 (9.6) were all above the limit of detection but only minimal compared to the testis. These observations question the hypothesis of SOAT variants as important transporters of the high amounts of sulfonated estrogens in bovine placentomes. Moreover, the results suggest that in cattle standard SOAT (variant 1) and its other isoforms play an important role especially in the testis, an organ, which however in the bovine species does not produce considerable amounts of sulfated estrogens.In addition to estrogens and progesterone, of which no biological role has been definitely identified yet in bovine placenta, in the bovine trophoblast androgens may also be produced and may have effects in bovine placentomes. In order to identify putative target cells of placental androgens, an immunohistochemical method was established to detect androgen receptor (AR) in bovine tissues using an antiserum raised against the N-terminus of human AR. Specificity of the primary antibody applied for bovine AR was confirmed by western blot and by control experiments using bovine epididymis as a positive control tissue. Throughout gestation, distinct nuclear signals were found in invasive TGC. As assessed by quantitative evaluation using an immunoreactive score, in TGC situated in the trophoblast, immature TGC, UTC, stromal cells of the chorionic villi, caruncular epithelial and stromal cells AR expression was low at early and midgestation but significantly increased during late gestation (p<0.01, resp.). Expression of AR was qualitatively confirmed on the mRNA-level by conventional RT-PCR. With real-time RT-PCR (taqman method) only a trend for an increased AR expression in the prepartal phase and at parturition was observed, which however was not statistically significant. Radioimmunological measurement of testosterone concentrations in bovine placental tissue yielded concentrations that must be considered sufficient to activate local ARs, and showed a significant increase (p<0.01) of mean testosterone concentrations from values slightly above background level (0.1 ng/g tissue) between days 50-100 to mean concentrations of 0.9 ng/g tissue during late gestation. The results suggest that androgens may be active products of bovine placental steroidogenesis and that they may be involved in the control of TGC differentiation. However, as steroid receptors are in part constitutionally active, it cannot be ruled out the ARs detected in bovine placentomes may have functions independent from the binding of steroidal ligands.In conclusion, results obtained in these studies provide new information on different aspects of bovine placental steroids and give starting points for new concepts on their functions. Die Plazenta stellt ein temporäres endokrines Organ dar, welches ein breites Spektrum verschiedener Hormone und bioaktiver Mediatoren produziert. Wie bei vielen Säugerspezies produziert sie auch beim Rind erhebliche Mengen an Steroiden, wobei aus quantitativer Sicht Progesteron und Estronsulfat die Hauptprodukte darstellen. Progesteron plazentaren Ursprungs trägt jedoch nur minimal und temporär zu den maternalen Blutspiegeln bei. Weiterhin interagiert das Hauptprodukt der plazentaren Östrogensynthese Estronsulfat nicht mit klassischen Östrogenrezeptoren. Daher ist die Bedeutung der plazentaren Steroidsynthese beim Rind immer noch unklar. Der Nachweis von Östrogen- bzw. Progesteronrezeptoren in den Plazentomen führte zur Hypothese, dass plazentare Steroide beim Rind nicht als Hormone im klassischen Sinn, sondern als lokale Regulatoren von Wachstum, Differenzierung und Funktionen der Plazenta selbst fungieren könnten. Eine Bestätigung dieses Konzepts durch entsprechende funktionelle Studien steht jedoch bisher noch aus, und neben der Frage nach der biologischen Bedeutung sind immer noch zahlreiche Fragen hinsichtlich Synthese und Transport der plazentaren Steroide, insbesondere der in großen Mengen gebildeten sulfatierten Östrogenen offen. Daher befassen sich diese Untersuchungen mit den folgenden drei Aspekten der plazentaren Steroidsynthese beim Rind: 1) Identifizierung des Syntheseortes der plazentaren sulfatierten Östrogene durch die Charakterisierung der Expression der östrogenspezifischen Sulfotransferase SULT1E1 auf zellulärer Ebene 2) die nähere Charakterisierung der Expression des Sodium-dependent Organic Anion Transporters (SOAT, syn.: SLC10A6) im Hinblick auf dessen Funktion als physiologisch relevanter Transsporter von sulfatierten Östrogenen 3) der möglichen Bedeutung von Androgenen als biologisch aktive Produkte der plazentaren Steroidsynthese.Zur Lokalisierung der SULT1E1 in den Rinderplazentomen auf zellulärer Ebene und zur quantitativen Erfassung der SULT1E1-Expression im Verlauf der Gravidität wurden zwei immunhistologische bzw. eine Real-time RT-PCR-Methode etabliert. Für den immunhistologischen SULT1E1-Nachweis wurden zwei Primärantikörper eingesetzt: ein polyklonales Antiserum aus Kaninchen gegen rekombinante bovine SULT1E1 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. R. Sullivan, Centre de Recherche en Biologie de la Reproduction and Departement d Obst´etrique-Gyn´ecologie, Facult´e de Med´ecine, Universit´e Laval, Qu´ebec, Kanada, sowie ein kommerzielles Antiserum aus der Maus gegen das entsprechende menschliche Enzym. Die Spezifität der beiden Primärantikörper für die bovine SULT1E1 wurde im Western Blot bestätigt. In der Immunhistologie ergaben sie weitgehend übereinstimmende Resultate. Im Gegensatz zu Resultaten früherer Untersuchungen unter Anwendung der Immunhistologie sowie der In situ-Hybridisierung, in denen die SULT1E1 in den Trophoblastriesenzellen (trophoblast giant cells, TGC) lokalisiert wurden, fanden sich in den eigenen Untersuchungen starke zytoplasmatische Signale ausschließlich in den einkernigen Trophoblastzellen (uninucleated trophoblast cells, UTC). Sobald UTC morphologisch erkennbar in die TGC-Differenzierung eintraten, wurde die SULT1E1-Expression rasch herunterreguliert. Unabhängig vom Trächtigkeitsstadium war in den Plazentomen eine starke SULT1E1-Expression in den UTC der Chorionplatte nachweisbar. In den UTC der Chorionzotten fand sich ein Gradient der SULT1E1-Expression mit Abnahme der Signalintensität von den basalen Anteilen der Stammzotten zu den Spitzen der Tertiärzotten. Mittels der Real-time RT-PCR konnte über den Verlauf der Gravidität ein Anstieg der SULT1E1-mRNA-Expression in der späten Gravidität sowie unter der Geburt festgestellt werden (p=0.0043), was im Einklang mit früheren Untersuchungen anderer Autoren steht. In Übereinstimmung mit dem in der Real-time RT-PCR festgestellten Anstieg der SULT1E1-mRNA-Expression in der Spätgravidität und unter der Geburt wurde in der Immunhistologie unter Verwendung des Primärantikörpers gegen die bovine SULT1E1 im entsprechenden Zeitraum ein Anstieg des Farbsignals festgestellt. Dieser war jedoch bei Verwendung des Primärantikörpers gegen die menschliche SULT1E1 nicht feststellbar. Weiterhin fand sich mit dem Primärantikörper gegen die bovine SULT1E1 in einem Teil der Proben neben dem prominenten Signal in den UTC ein deutlich schwächeres zytoplasmatisches Signal im Karunkelepithel. Bei einem Vergleich der SULT1E1-mRNA-Expression in Proben verschiedener Organe gemessen mittels Real-time RT-PCR - zeigte sich, dass beim Rind die Plazenta (Tag 272) die weitaus höchste Expression aufweist (2851 relative Einheiten, RU), gefolgt von der fetalen Leber (Tag 185: 748 RU; Tag 210: 816 RU). In Organen adulter Rinder war die SULT1E1-Expression weitaus niedriger mit höchsten Messwerten in der Nebenniere (144 RU), gefolgt von der Haut (91 RU). In den restlichen untersuchten Organen adulter Rinder, inclusive der Leber (21 RU), war sie vergleichsweise minimal.Die Ergebnisse zeigen überzeugend, dass die bisher publizierte Lokalisation der SULT1E1 in den TGC offensichtlich nicht zutrifft, sondern dass sie in den Plazentomen des Rindes vorwiegend in den UTC exprimiert wird, wodurch diese Zellen vermutlich vor den in den TGC produzierten Östrogenen geschützt werden. Möglicherweise ist die SULT1E1 daher in die Kontrolle der Trophoblastriesenzelldifferenzierung involviert.Ziel des zweiten Teils dieser Untersuchung war die weitergehende Charakterisierung der Expression der fünf bisher identifizierten Isoformen des SOAT in den Plazentomen und vergleichsweise in anderen Organen des Rindes. Für die aus Rinderplazentomen klonierte SOAT-Standardform (Variante 1) konnte kürzlich in vitro gezeigt werden, dass sie effektiv den zellulären Import von Estronsulfat vermittelt, weshalb sie als physiologisch relevanter Transporter des während der Gravidität des Rindes in großen Mengen produzierten Estronsulfats infrage kommt. Über das Expressionsmuster der restlichen vier Varianten sowie über deren Funktionalität lagen bisher keinerlei Informationen vor. Für alle fünf Varianten des Rinder SOATs wurden spezifische konventionelle RT-PCR-Methoden etabliert. Unter Anwendung dieser Verfahren wurden Plazentomproben aus unterschiedlichen Trächtigkeitsstadien untersucht. Zu Vergleichszwecken wurden parallel Untersuchungen an einem breiten Spektrum von Rinderorganen bzw -geweben durchgeführt. Für die SOAT-Isoformen 1, 2 und 5 waren spezifische PCR-Produkte in allen untersuchten Proben nachweisbar. Auch die Expression der Variante 3 war in den meisten Proben nachweisbar. Banden für Variante 4 waren dagegen meist schwach oder nicht nachweisbar. Die Etablierung isoformspezifischer Real-time RT-PCR-Methoden war für die Varianten 1, 2, 3 und 5 erfolgreich. Mit ihnen konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Varianten in den Rinderplazentomen in der frühen und mittleren Gravidität weitgehend konstant ist, während unter der Geburt die im maternalen Teil der Plazentome gemessene Expression im Mittel um mehr als den Faktor 10 höher war. Bei vergleichenden Messungen der SOAT-Varianten-Expression in verschiedenen Rindergeweben und organen wurde für die Varianten 1, 2 und 5 die weitaus höchsten Werte im Hoden gemessen (1253 RU, 8195 RU bzw. 4575 RU). Variante 1 wurde daneben deutlich in der Haut (734 RU), dem Euter (282 RU) und im Colon (233 RU) exprimiert. Außer im Hoden war Variante 2 in der Haut (1410 RU) deutlich nachweisbar. Für Variante 3 wurde die höchste Expression ebenfalls im Hoden (158 RU) nachgewiesen, wo sie allerdings nur unwesentlich höher war als im Ovarstroma (113 RU). Das Spektrum messbarer SOAT-Isoformen-mRNA wies zwischen den untersuchten Organen und Geweben erhebliche Unterschiede auf. Messenger-RNA für alle vier mittels Real-time RT-PCR erfassten Isoformen konnte lediglich in Hoden, Plazenta und Corpus luteum gemessen werden. In den Plazentomen war die relative Genexpression aller erfasster Varianten zwar über der Nachweisgrenze (Variante 1: 5,3 RU, Variante 2: 31,8 RU, Variante 2: 2,5 RU, Variante 5: 9.6 RU), aber nur minimal im Vergleich zur Expression im Hoden. Die im Vergleich zu anderen Organen überaus schwache Expression der SOAT-Varianten in der Plazenta stellt die postulierte Bedeutung des SOAT als physiologisch relevanter Transporter für die großen Mengen trächtigkeitsspezifischer sulfatierter Östrogene beim Rind infrage. Weiterhin lassen die Ergebnisse zur SOAT-Expression erkennen, dass dieser insbesondere im Hoden eine besondere Rolle spielt, einem Organ, welches beim Rind jedoch keine nennenswerten Mengen an sulfatierten Östrogenen produziert.Bisherige Vorstellungen zur Bedeutung der plazentaren Steroidsynthese beim Rind basieren auf der Annahme, dass Progesteron und/oder Östrogene deren biologisch aktive Produkte darstellen. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass auch andere Steroide wie z.B. Androgene, die ebenfalls im Trophoblast produziert werden, in den Plazentomen regulatorische Funktionen erfüllen. Zur Identifizierung möglicher Zielzellen plazentarer Androgene wurde ein immunhistochemisches Verfahren zur Darstellung von Androgenrezeptoren in Rindergeweben unter Verwendung eines Primärantikörpers gegen den N-Terminus des menschlichen Androgenrezeptors etabliert. Die Spezifität des Primärantikörpers für den Androgenrezeptor des Rindes wurde im Western Blot und in immunhistologischen Kontrollexperimenten bestätigt, in denen Nebenhoden eines Bullen als Positivkontrolle verwendet wurde. In den Plazentomen fanden sich während der gesamten Gravidität deutliche nukleäre Signale in invasiven TGC. Wie die quantitative Auswertung der Immunfärbung mittels eines immunreaktiven Scores ergab, war die Androgenrezeptorexpression in den reifen, noch im Trophoblasten gelegenen TGC sowie in unreifen TGC, UTC, den Stromazellen der Chorionzotten, dem Karunkelepithel und den Karunkelstromazellen in der frühen und mittleren Gravidität nur schwach, stieg aber in der Spätphase der Gravidität signifikant an (p jeweils < 0.01). Die Expression von Androgenrezeptoren in den Plazentomen wurde qualitativ mittels konventioneller RT-PCR bestätigt. Bei der Messung der Androgenrezeptor-mRNA-Expression mittels Real-time RT-PCR ergab sich ein tendenzieller Anstieg der relativen Genexpression, der jedoch nicht statistisch signifikant war. Bei der radioimmunologischen Messung der Testosteronkonzentration im Plazentomgewebe ergab sich ein Anstieg der Messwerte (p<0.01) von Konzentrationen geringfügig über der Nachweisgrenze des Messverfahrens (0.1 ng/g Gewebe) zwischen den Tagen 50-100 bis auf Konzentrationen um 0.9 ng/g Gewebe während der späten Gravidität. Diese Konzentrationen müssen als ausreichend angesehen werden, lokal im Gewebe vorhandene Androgenrezeptoren zu aktivieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass beim Rind Androgene biologisch aktive Produkte der plazentaren Steroidsynthese darstellen und eine Rolle in der Steuerung der TGC-Differenzierung spielen könnten. Andererseits könnte der Androgenrezeptor auch androgenunabhängige Funktionen erfüllen, da die Aktivität von Steroidrezeptoren teilweise ligandunabhängig ist.Die in dieser Arbeit insgesamt erhaltenen Resultate ergaben neue Informationen zu verschiedenen Aspekten der Steroidsynthese in der Rinderplazenta und erbrachten Ansatzpunkte für neue Hypothesen hinsichtlich deren funktioneller Bedeutung.