Tumorinduzierte Angiogenese in Tumor-Stammzell- Konfrontationskulturen : ein neues Tierversuchsersatzmodell für das Screening anti-angiogener Substanzen

Abstract

Das Wachstum und Metastasierungspotential eines Tumors steigt mit seiner vaskulären Versorgung. In dieser Arbeit wurde die Tumorinduzierte Angiogenese in einem in vitro System untersucht, das gewährleistet, diesen Prozess unter beinahe physiologischen Bedingungen (Zell-Zell und Zell-extrazelluläre Matrixinteraktionen) zu beobachten. Das aus embryonalen Stammzellen hergestellte EB ist in der Lage, die vom Tumorsphäriod ausgehenden Signale zu empfangen und mit gezielter Differenzierung auf die selbigen zu reagieren.Es konnte gezeigt werden, dass Wechselwirkungen zwischen Tumorsphäroiden und EBs zu einer zeitnahen Vaskularisation des Tumorgewebes und gesteigerter Angiogenese beteiligter EBs führen. Die neu entstandenen Gefäße wachsen bevorzugt auf den Tumor zu. Zugabe von VEGF hebt jedoch das gerichtete Wachstum auf, was auf eine Beteiligung von VEGF in diesem Prozess hindeutet. Folglich führte die Zugabe von Tyrozinkinase-Rezeptor hemmenden Substanzen SU5614 und ZM323881 zu einer reduzierten Vaskularisierung in EBs und in Tumorsphäroiden in Kokultur. Das u.a. für seine VEGF senkenden Eigenschaften bekannte Thalidomid zeigte ebenfalls einen konzentrationsabhängigen reduzierenden Effekt auf die Vaskularisation der EBs und der in Kokultur befindlichen Tumorsphäroide. Allerdings führten alle eingesetzten Inhibitoren zu keiner signifikanten Veränderung der endothelialen Zellzahl. Es wurde zusätzlich ein positiver konzentrationsabhängiger Effekt der Thalidomidbehandlung auf die kardiale Differenzierung beobachtet, was sich in einer gesteigerten Anzahl kontrahierender Bereiche, eine Vergrößerung der Fläche von kardialen α-Aktinin positiven Arealen und der mRNA und Proteinexpression kardialer Marker zeigte. Der schon publizierte Effekt des Thalidomid-Racemates auf die Erhöhung der intrazellulären ROS Produktion konnte auch mit der für ihre antiangiogene Wirkung verantwortlichen (-)- Isoform gezeigt werden. Zudem konnten die NADPH-Oxidase und die Mitochondrien als Quelle der ROS durch Koinkubation mit dem NADPH-Oxidase Inhibitor VAS2870 und dem Inhibitor des Komplex I der Mitochondrien Rotenon ausgemacht werden. Die durch NADPH 7. Zusammenfassung 133 generierten ROS haben einen negativen Effekt auf die endotheliale, jedoch einen positiven auf die kardiale Differenzierung. Es konnte gezeigt werden, dass Thalidomid einen senkenden Effekt auf die intrazelluläre NO Produktion der EBs hat, was durch Koinkubation von Thalidomid mit dem NO-Donor SNAP bestätigt wurde. Als eine der Quellen des NO konnte die eNOS identifiziert werden, da es bereits 5 min nach Zugabe von Thalidomid zu einer signifikanten Abnahme der eNOS Phosphorylierung kam. Eine Steigerung der NO-Generierung zeigte im EB-Modell einen deutlichen proangiogenen Effekt, während eine Inhibition sowohl die vaskuläre, als auch die kardiale Differenzierung reduzierte. Zusätzlich sollte in diesem Projekt die Etablierung der humanen Stammzellkultur durchgeführt werden, um die Möglichkeit der Herstellung von humanen Konfrontationskulturen zu testen. Hierfür wurden die Stammzelllinien H1 und H9 miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass der Einsatz von humanen Kokulturen grundsätzlich möglich ist, jedoch bestehen wesentliche Unterschiede zwischen den einzelnen Linien bezüglich ihrer Differenzierungsmöglichkeiten. Ein sorgfältiges Screening der Zelllinien ist daher notwendig, um die am besten geeignete Zelllinie für den jeweiligen Differenzierungsansatz zu ermitteln. Vascularization is the prerequisite for tumour growth and metastasis. In this study tumourinduced angiogenesis was analysed using an in vitro co-culture model which mimics physiological conditions through cell to cell and cell to extracellular matrix interactions. The embryonic stem cell-derived embryoid body (EB) is capable to receive signals released by the tumour, transduce them and answer through differentiation processes. In the present study it is shown that interactions between tumour spheroids and EBs led to vascularization of the tumour tissue as well as to increased angiogenesis in co-cultured EBs. The newly developed vessels showed tumour-directed growth, which was lost when medium was supplemented with VEGF, suggesting a major role of this growth factor in tumour angiogenesis. Consequently, treatment with tyrosine-kinase inhibitors resulted in decreased vascularization of EBs as well as vascularised tumours in co-culture. Comparable effects occurred by treatment with thalidomide, a substance known to reduce serum levels of VEGF. It was observed that none of the inhibitors significantly changed the number of endothelial cells, suggesting that the compound acted on vascular sprouting rather then on differntiation of endothelial cells. Furthermore it was observed that treatment with thalidomide positively influenced cardiac development, as shown by higher numbers of beating foci, increased α-actinin positive areas, as well as expression of mRNA and protein of cardiac markers. It was shown, that treatment with (-)-thalidomide led to increased intracellular ROS levels. Treatment with the NADPH-Oxidase specific inhibitor VAS2870 and the inhibitor of mitochondrial complex I rotenone, pointed towards NOX enzymes and mitochondria as sources of ROS production. By incubating the samples for longer time with VAS2870, a inhibitory effect was observed regarding vasculature, whereas it seems that higher ROS levels generated by the NADPH-Oxidase are necessary for cardiac development. 8. Summary 135 Further experiments were undertaken to analyse the effect of thalidomide treatment on intracellular NO-levels, since NO is known to be a pro-angiogenic stimulus. Indeed it was observed that thalidomide dose dependent decreased NO generation, which was verified by co-incubation of the samples with the NO donor SNAP as a positive control. The source of NO was supposed to be phosphorylated eNOS, since treatment with thalidomide led to a 30% decrease in phosphorylation within 5 min. By investigating the importance of NO, treatments with thalidomide, SNAP and combination of both were performed. SNAP exerted a highly positive effect on the vascular differentiation. The inhibition of NO generation with L-NAME, as well as NO scaveging with carboxy-PTIO led to significally reduced vasculogenesis and cardiomyogenesis. To verify whether confrontation cultures could be established from human ES cells vasculogenesis was studied in the H1 and H9 human ES cell lines. It was found that the H9 cell line displayed superior vascular differentiation potential as compared to H1 cells. H9 EBs successfully formed confrontation cultures when colocalised with prostate cancer spheroids. Confrontation culture of human ES cells with tumour tissues will allow screenings of antiangiogenic agents in a human tissue enviroment.