Wirksamkeitsprüfung chemischer Verfahren zur Desinfektion von Coxiella burnetii in kontaminierten Bodenmatrizes

Abstract

Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, die Wirksamkeit der chemischen Desinfektion von Boden¬matrizes, die mit dem zoonotischen Krankheitserreger Coxiella burnetii kontaminiert sind, zu prüfen. Die Prüfung der Desinfektionsmittel Ameisensäure, Kalkmlich, Natronlauge und Formalin erfolgte bei einer Umgebungstemperatur von 10 °C in sogenannten Suspensions- und Keimträgerversuchen, die zu diesem Zweck etabliert wurden. Zur Beurteilung der Desinfektionswirkung wurden Verfahren entwickelt, bei dem die Des¬infektions¬wirkung in Anlehnung an deutsche und europäische Prüfnormen an der Keim¬zahl¬reduktion einer exponierten Prüfkeimmenge gemessen wurde. Dabei beruhte das Prinzip der Keim¬zahl¬bestimmung auf der Endpunkttitration fraglicher Erregersuspensionen in BGM-Zell¬kulturen und dem Auswertungsverfahren nach SPEARMAN und KÄRBER (zitiert nach Mayr et al., 1974). Die Phasenkontrastmikroskopie erwies sich bei diesem Verfahren als hin¬reichend robust, um C. burnetii-infizierte und nicht infizierte Zellkulturen sicher von¬einander zu unter¬scheiden.Für die vier Des¬infektions¬mittel Ameisensäure, Kalk¬milch, Natron¬lauge und Formalin wurden durch die lichtmikroskopische Untersuchung jeweils Konzentrationen be¬stimmt, bei denen Schädigungen der BGM-Zellen und damit Be¬einträchtigungen der Methode zur Bestimmung der C. burnetii-Lebendkeimzahl aus¬ge¬schlossen sind. Insgesamt erwies sich Formalin als das Des¬infektionsmittel mit dem höchsten zyto¬toxischen Potential. Erst ab einer Kon¬zentration von 0,0005 % Formalin waren keine morpho¬lo¬gischen Veränderungen der BGM-Zellen mehr nach¬weisbar, während Ameisensäure, Kalk¬milch und Natron¬lauge bereits ab Kon¬zen¬tra¬tionen von 0,004 %, 0,007 % bzw. 0,004 % von den BGM-Zellen toleriert wurden. Zudem hatten die Desinfektionsmittel in diesen Konzentrationen keinen Ein¬fluss auf die C. burnetii-Lebendkeimzahl. Die Zugabe von L Histidin konnte die Zytotoxizität des Formalins nicht reduzieren, vielmehr wirkte L Histidin sogar selbst toxisch auf die BGM-Zellen. In weiteren Versuchen wurde die desinfizierende Wirkung von 4 % Ameisen¬säure, 1,9 % Kalk¬milch, 2 % Natronlauge und 6 % Formalin auf die C. burnetii-Prüf¬suspen¬sion bei einer Einwirk¬temperatur von 10 °C und einer Einwirkdauer von 24 Stunden in einem Suspensions¬versuch untersucht. Um Keimreduktionen um mindestens den Faktor 105 erfassen zu können, wurden die Desinfektionsmittel am Ende der Einwirkzeit durch Zentrifugation aus den Testansätzen entfernt, bevor diese auf die BGM-Zellen inokuliert wurden. Die mittlere Lebend¬keimzahl der C. burnetii-Stamm¬suspen¬sion war mit 3,0 x 109 KID50/ml ausreichend hoch, um sie zur Wirksam¬keits¬prüfung von Des¬infektions¬mitteln einzusetzen. Ameisensäure reduzierte selbst unter Eiweißbelastung die C. burnetii-Lebend¬keimzahl der Prüf¬sus¬pen¬sion in den zwei voneinander un¬abhängigen Versuchen um mehr als 5 log10-Stufen. Kalk¬milch und Formalin erreichten diesen Reduktionsfaktor nur unter Eiwei߬belastung. Die Natron¬lauge wies den geforderten Reduktionsfaktor jeweils nur in einem der beiden Versuche auf.In weiteren Versuchsreihen wurde das Protokoll für Keimträgerversuche an Bodenmatrizes entwickelt, wobei die Standardböden Sand, Löß und Lehm verwendet wurden. 50 ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen-Copolymer waren als Reaktionsgefäße zur Modellierung der Bodendesinfektion am besten geeignet. Günstig war es ferner, die Bodenproben vor dem Ansetzen der Reaktionen mit 20 % ihrer maximalen Wasserbindungskapazität zu rehydrieren, da sich hierbei die dann später sukzessive aufge¬tragenen Inokula an C. burnetii-Prüfsuspension und Des¬infektions¬mittel¬lösung in der Bodenprobe gut vermischten. In dem etablierten Modell waren die getesteten Desinfektionsmittel unter praxisorientierten Bedingun¬gen (24 h Einwirkzeit, 10 °C Temperatur, Eiweißbelastung) unterschiedlich wirksam. Die 2 %ige Na¬tron¬¬lauge reduzierte die C. burnetii-Lebend¬keim¬zahl auf allen drei Bodentypen in drei voneinander un¬ab¬hängigen Versuchen um mindestens den Faktor 104. Die 6 %ige Formalin¬lösung erreichte diesen Reduktionsfaktor bei Sand und Lehm in drei Ver¬suchen und die 4 %ige Ameisensäure bei Sand. In einzelnen Testansätzen waren allderdings noch kulturinfektiöse C. burnetii-Keime nachweisbar. Außerdem blieb die mit 1,9 %iger Kalkmilch erzielte Keimreduktion vor allem bei Löß und Lehm unter dem kritischen Reduktions¬faktor von 104.Die Untersuchungen belegen, dass eine chemische De¬kontamination von C. burnetii-belasteten Bodenmatrizes möglich ist, und erlauben es, wissen¬schaftlich fundierte Empfehlungen für die Desinfektionspraxis abzuleiten. Somit steht nunmehr ein valides Modell zur Verfügung, um in zukünftigen Studien auch alternative Des¬infektions¬verfahren (Wärme, UV-Einstrahlung, Ultraschall) sowie die unterschiedliche Tenazität der verschiedenen C. burnetii-Varianten ( small cell variants und large cell variants ) zu untersuchen und in ihrer Bedeutung für das Q-Fieber-Risiko bewerten zu können. The objective of the present study was to evaluate chemical disinfection of soil matrices contaminated with the zoonotic pathogen Coxiella burnetii. Suspension assays and quantitative surface assays were established and used to prove formic acid, cream of lime, sodium hydroxide, and formalin at 10 °C for their efficacy as a disinfectant. A test procedure related to German and European standards was developed where efficacy of disinfection was measured by the numeric reduction of infectious C. burnetii in aqueous suspensions or soil matrices exposed to the disinfectant. For counting of infectious C. burnetii bacteria, the respective bacterial suspension was submitted to end point titration in BGM cell cultures followed by a titre calculation according to SPEARMAN and KÄRBER (quoted by Mayr et al., 1974). Phase-contrast microscopy proved sufficiently robust to differentiate between non infected cell cultures and cell cultures infected with C. burnetii.In order to validate the counting system of infectious bacteria, the cytotoxic activities of four disinfectants (formic acid, cream of lime, sodium hydroxide solution and formalin) were deter¬mined by endpoint titration and light microscopy analysis of BGM cells. Formalin proved as the most cytotoxic disinfectant because only concentrations equal or less than 0.0005 % were tolerated by the BGM cells. In contrast, 0.004 % formic acid, 0.007 % cream of lime, and 0.004 % of sodium hydroxide solution induced no detectable cell lesions. Additionally, the four disinfectants did not alter the quantification of viable C. burnetii when they were utilized in these con¬cen¬trations. L histidine failed to reduce the cytotoxic activity of formalin, it even damaged the eukaryotic cells itself.In a quantitative suspension test the C. burnetii standard suspension was incubated with 4 % formic acid, 1.9 % cream of lime, 2 % sodium hydroxide, or 6 % formalin, respectively, for 24 hours at 10 °C with and without interfering proteins. In order to measure the reduction of infectious bacteria over at least five orders of magnitude, disinfectants were removed from reaction mixtures by centrifugation at the end of the incubation period. The mean bacterial cell count of the used C. burnetii stock suspension was 3.0 x 109 KID50/ml. Using this technique, only formic acid proved efficient to reduce the number of infectious C. burnetii bacteria by more than 5 log10 with and without interfering proteins in two independent assays. Cream of lime and formalin achived this reduction factor only with interfering proteins. Sodium hydroxide reduced the bacteria by at least 5 log10 in only one assay.Subsequently, a quantitative surface test was developed utilizing standardized soil materials (sand, loess, clay) as carriers to be disinfected. Centrifuge tubes (50 ml, polypropylene copolymer) were most suitable for modelling the disinfection of the soil. For optimal handling, the soil samples had to be rehydrated before use with 20 % of their individual maximum water holding capacity. These rehydrated soil samples were feasible for an experimental contamination with the standardized C. burnetii suspension and subsequent application of disinfectant solution. The disinfectants proved differently efficient in the established test under the conditions applied (10 °C, 24 h incubation, interfering proteins). Sodium hydroxide solution (2 %) reduced the number of infectious C. burnetii bacteria by more than 4 log10 on all three soil types in three independently repeated assays. This reduction factor was achieved with formalin (6 %) on sand and clay in three assays, with formic acid (4 %) on sand. In some treated material viable C. burnetii bacteria were still detected. The reduction of bacteria obtained with cream of lime (1.9 %) remained under the critical factor of 104 using loess and clay.This research proves the feasibility of chemical decontamination of C. burnetii containing soil. According to these results deducing scientifically founded recommendations for disinfection is now possible. Thus, there is a valid model available to investigate alternative methods of disinfection (heat, UV radiation, ultrasound) as well as the different tenacity of the variants of C. burnetii ( small cell variants and large cell variants ) and to evaluate their meaning for the risk of Q-fever.