Molekularbiologische Untersuchungen an 82 Feldisolaten und 9 Reisolaten aus Lebendimpfstoffen des Virus der Infektiösen Bronchitis (Coronaviridae, Speziesgruppe 3) des Haushuhns (Gallus gallus)

Abstract

Das Virus der Infektiösen Bronchitis (IBV) verursacht eine hoch ansteckende Krankheit der Hühner mit Beteiligung des Respirations- und manchmal des Urogenitaltrakts, die zum Abfall der Legeleistung mit verminderter Eiqualität führt. Einige Stämme dieses Virus zeigen einen renalen Tropismus und verursachen bis zu 30 % Sterblichkeit in den betroffenen Herden. Trotz des intensiven Einsatzes von Impfungen ist die infektiöse Bronchitis (IB) weltweit ein sehr bedeutendes Problem in der Geflügelindustrie und verursacht noch immer große wirtschaftliche Verluste in vielen Ländern, darunter auch in Deutschland. Die Isolierung und genaue Typisierung von IBV-Feldisolaten sind nicht nur für die Evolution des Virus bedeutsam, sondern auch für wirksame Änderungen der bestehenden Impfprogramme. Traditionelle Methoden zur Identifizierung von IBV-Serotypen, wie Hämaglutinationshemmungstest und Virusneutralisationstest, sind arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Seit Anfang der 1990er Jahre wurde die Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) für die schnelle Identifizierung von IBV-Genomen erfolgreich angewandt. Die genotypspezifische RT-PCR und / oder die Sequenzierung des S1-Gens mit Hilfe geeigneter Primer wurden für die rasche Differenzierung von IBV-Stämmen ebenso als sehr hilfreich erkannt. In der vorliegenden Studie wurden 82 Isolate in Form von virushaltiger Allantoisflüssigkeit untersucht, die zwischen 1978 und 2006 in Deutschland isoliert, gesammelt und als IBV-verdächtige Isolate eingefroren wurden. Für den Nachweis von IBV in diesen Proben wurden sowohl konventionelle RT-PCR als auch Real Time RT-PCR mit Oligonukleotidpaaren, die innerhalb der sehr konserviert erhaltenen Region des N-Gens binden, durchgeführt.Es wurden verschiedene Äußere-RT-PCR und Nested-Multiplex-PCRs durchgeführt, um fünf verschiedene Genotypen bzw. Typen von IBV: Massachusetts, D274, D1466, 793B (auch als 4/91 und CR88121 bekannt) und Italy 02 nachzuweisen und zu differenzieren.Insgesamt wurden alle 82 Isolate durch Nachweis des N-Gens als IBV identifiziert. 76 von 82 Isolaten konnten durch auf dem S1-Gen basierenden genotypspezifischen Nested-Multiplex-PCRs differenziert werden. 25 Isolate gehören zum Genotyp D274, 24 zum Genotyp Massachusetts, 14 zum Genotyp 793B, sechs Isolate zum Genotyp D1466, sechs Isolate erwiesen sich als Mix-Isolate und lediglich ein Isolat als Genotyp Italy 02. Bei den Mix-Isolaten handelte es sich um vier Isolate Massachusetts/D274, ein Isolat aus Massachusetts/793B und ein Isolat aus Italy 02/793B Mischkulturen. Die sechs Isolate, die nicht mittels Nested-Multiplex-PCR differenziert werden konnten, wurden mit dem Oligonukleotidpaar S1uni (-) und XCE1 (+) bzw. XCE3 (-) und XCE1 (+) amplifiziert und anschließend sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Sequenzen anderer Isolate in der Genbank verglichen. Zwei von sechs sequenzierten Isolaten zeigten eine vollständige Sequenzhomologie (100 %) mit dem chinesischen QX-IBV. Ein Isolat hatte 97 % Homologie mit dem belgischen B1648. Ein anderes Isolat hatte 91 % Homologie mit dem Isolat IS/885. Eine viel niedrigere Homologie (83 %) zeigte ein Isolat mit Isolat PA/1220/98. Bei einem anderen Isolat wurde eine 99 %ige Sequenzhomologie mit FR-94047-94 festgestellt.Die meisten der differenzierten Isolate waren den Genotypen D274 und M41 zuzuordnen. Der dominierende Genotyp in den 1980er Jahren war der Genotyp D274. Der Genotyp M41 wurde regelmäßig während der gesamten Untersuchungszeit isoliert. Die Ergebnisse zeigen seit 1991 eine weite Verbreitung des Genotyps 793B in Deutschland. Der Genotyp Italy 02 tritt erst nach 2001 und eher selten auf. Die hohe Sequenzhomologie mit dem chinesischen Genotyp QX-IBV von zwei Isolaten, die aus dem Jahre 2004 stammen, lässt vermuten, dass QX-IBV erst seit Beginn dieses Jahrtausends in Deutschland präsent ist. Darüber hinaus zeigen die Sequenzierungsergebnisse die gleichzeitige Koexistenz von verschiedenen Varianten des IBV im erwähnten Zeitraum in Deutschland. Molecular studies on 82 field isolate and 9 reisolate of IB live vaccines of infectious bronchitis virus (Coronaviridae, species group 3) of domestic chicken (Gallus gallus)Infectious bronchitis virus (IBV) causes a highly contagious disease in chickens that affects the respiratory and sometimes urogenital tract. IBV infection leads to reduced egg production and eggshell quality in layer hens and some virus strains exhibit a renal tropism and produce up to 30 % mortality in affected flocks. In spite of intensive vaccination programmes, infectious bronchitis (IB) is still a major health problem in the poultry industry and causes economic losses in many countries, including Germany. The isolation and typing of IBV field isolates are very important not only for the study of virus evolution, but also for effective modifications of vaccination programmes. Traditional methods for identification of IBV serotypes, haemagglutination-inhibition and virus neutralization tests, are both labour-intensive and time consuming. The reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) has been successfully applied for rapid identification of IBV genomes since the early 1990s. Type-specific RT-PCR and/or nucleotide sequencing of the S1 gene region using appropriate primers are recognized as useful and fast techniques for the differentiation of IBV field strains. In this present study, 82 samples of IBV in allantoic fluid were investigated. The samples were collected in Germany between 1978 to 2006 and temporarily stored as IBV-like isolates. For the detection of IBV in these samples, both conventional RT-PCR as well as real time RT-PCR with oligonucleotide pairs binding within highly conserved region of the N gene, were used. Different outer-RT-PCR´s and Nested-Multiplex-PCR´s were performed to detect and differentiate five genotypes of IBV: Italy 02, Massachusetts, D1466, D274 and 793B (also known as 4/91 and CR88121). All of the 82 samples were identified as IBV by detecting the N gene. 76 of the 82 isolates could be differentiated by Nested-Multiplex-PCR based on the S1 gene: 25 isolates as D274, 24 isolates as Massachusetts, 14 isolates as 793B, six isolates as D1466, six isolates as mix-type and one isolate Italy 02. The six isolates which could not be differentiated by Nested-Multiplex-PCR, were amplified with oligonucleotide pair S1uni (-) and XCE1 (+) or XCE3 (-) and XCE1 (+) and subsequently sequenced. The obtained sequences were compared with sequences of other isolates in the gene bank. Two of six sequenced isolates showed a high sequence homology (100 %) with the S1 amplyfied fragment of the IBV Chinese QX-IBV. One isolate had 97 % similarity to Belgian B1648, one isolate had 91 % to IS/885. A much lower (83 %) similarity was observed between one of the sequenced isolates with PA/1220/98. One isolate had 99 % similarity to FR-94047-94 strain.The majority of the differentiated genotypes were D274 and M41. The dominant genotype in the 80s was genotype D274. The genotype M41 was frequently isolated during the time period from 1978 to 2006. The results indicate an active circulation of the genotype 793B in Germany since 1991. The genotype Italy 02 occured infrequently after 2001. The high sequence homology between the two isolates collected in 2004 might indicate the introduction of a novel IBV variant QX-IBV into Germany at the beginning of the millenium. Furthermore the sequence analysis revealed the co-existence of different variants of IBVs during the time of investigation in Germany.