Veränderungen der Expression von Neurofilamenten und des DISC1-Proteins im Gehirn nach neonataler Infektion von Lewis-Ratten mit dem Borna Disease Virus

Abstract

Ziel der experimentellen Infektion von neugeborenen Ratten mit dem BDV war, ein Modell einer lebenslangen Viruspersistenz im Zentralnervensystem zu erzeugen, ohne wesentliche immunpathologische Reaktionen auszulösen. Es dient als repräsentatives Modell zur Erforschung von Störungen der Hirnentwicklung und Hirnfunktion durch nicht zytopathogene RNA-Viren.In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Charakterisierung struktureller Veränderungen und die Untersuchung der Auswirkungen der Infektion auf Neurofilamente und andere neuronale Proteine, die vermutlich auch bei verschiedenen neuropsychiatrischen Krankheiten eine Rolle spielen. Bei der hier durchgeführten, nicht invasiven Infektion mit einem virushaltigen Aerosol ist der Grad der Immuntoleranz ungleich höher und entzündliche Reaktionen spielen eine wesentlich geringere Rolle als mögliche Ursache für neurodegenerative Veränderungen als bei der herkömmlichen intracerebralen Infektion immunkompromittierter Ratten.In den eigenen Untersuchungen wurden neugeboren infizierte Lewis-Ratten sowie gesunde Kontrolltiere verwendet. Von den Gehirnen der Tiere wurden Stufenschnitte angefertigt und neben Standardfärbungen immunhistochemische Färbungen mit Markern für BDV-Protein, DISC1-Protein und NUDEL-Protein durchgeführt. Um die hirnmorphologischen Veränderungen näher zu untersuchen, wurden Marker für phosphorylierte und nicht phosphorylierte Neurofilamente verwendet. Zwölf der 13 NBAE-Ratten zeigten das typische Bild der persistierenden toleranten Infektion ohne infiltrierende Immunzellen. Mit zunehmendem Alter exprimierten diese Ratten immer mehr BDV-Protein in Zellen aller Gehirnregionen und zeigten Mikrogliose und Astrozytose. Bis zu einem Alter von vier Wochen zeigten die infizierten Ratten eine physiologische Zelldichte, ab der sechsten Lebenswoche ließ sich eine fortschreitende Reduktion der Purkinje-Zellzahl beobachten, die sich bis zur 22. Woche steigerte. Bei zwei Ratten im Alter von sechs Wochen fanden sich perivaskuläre Mini-Infiltrate, dabei handelt es sich höchstwahrscheinlich um eine transiente unspezifische Immunantwort. Eine der vier Wochen alten Ratten zeigte eine ausgeprägte lymphozytäre Entzündungsreaktion. Wahrscheinlich war bei diesem Tier die Infektion am ersten Lebenstag nicht erfolgreich und die Aufnahme von BDV, vermutlich von infizierten und virusausscheidenden Geschwistertieren, führte im höheren immunkompetenten Alter zur Infektion. Mit fortschreitendem Alter der Ratten konnten zunehmend Veränderungen der Neurofilamente beobachtet werden. Die nicht phosphorylierten Neurofilamente stellten sich bei den infizierten Tieren weniger deutlich dar. Während sich bei den Kontrolltieren die nicht phosphorylierten Neurofilamente in höherem Alter auch in Dendriten und Axonen darstellen ließen, waren diese bei den infizierten Tieren nur schwach und diskontinuierlich zu erkennen. Die phosphorylierten Neurofilamente stellten sich bei den gesunden Kontrolltieren in jedem Alter als feiner, die Nervenzelle umgebender Saum dar. Dendriten und Axone waren deutlich zu erkennen. Im Vergleich dazu bildeten die phosphorylierten Neurofilamente bei den infizierten Tieren körnige Kondensationen und Aggregationen. Die Dendriten und Axone waren aufgetrieben, unterbrochen und wirkten an vielen Stellen perlschnurartig aufgetrieben. Bei den Kontrolltieren wurde das DISC1-Protein im Zytoplasma und Zellkern des Neurons exprimiert, während es bei den NBAE-Tieren nur im Zellkern exprimiert wurde. Die veränderte Expression des DISC1-Proteins war besonders im Sektor CA2 im Zellband des Hippocampus zu sehen. Die Anzahl der DISC1-exprimierenden Zellen, ebenso wie die Intensität der intranukleären Proteinexpression, nahm bei den infizierten Ratten deutlich zu. Ein Effekt, der sich mit zunehmendem Alter im Sinn einer Hyperexpression des DISC1-Proteins noch verstärkte. Diese Ergebnisse zeigen, dass BDV die Bildung, Entwicklung und Dynamik der Neurofilamente stört und auch einen direkten oder indirekten Einfluss auf die DISC1-Expression hat. Es bleibt zu klären, wie das BDV dabei in die Neurofilament-Entwicklung eingreift. Es ist bekannt, dass das DISC1-Protein für die Bildung und Aufrechterhaltung des Zytoskeletts einen hohen Stellenwert hat, was wiederum die gesamte Hirnfunktion betrifft. Daher ergibt sich die Annahme, dass Veränderungen am DISC1-Protein entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung der Neurofilamente haben. Diese pathologischen Befunde spielen daher möglicherweise eine signifikante Rolle bei der neurologischen Erkrankung neonatal BDV-infizierter Ratten. Veränderungen an Neurofilamenten sind ein häufiger Befund bei verschiedenen humanen neurodegenerativen Krankheiten. Somit scheinen die BDV-NBAE-Ratten ein geeignetes Modell darzustellen, um die Pathogenese solcher nicht immunvermittelter, neurodegenerativer Krankheiten besser verstehen zu lernen. Um genauere Aussagen über die Beteiligung der BDV-Infektion an der Entstehung von neuropsychiatrischen Krankheiten zu treffen, müssen in Zukunft Ausmaß, Spezifität und mögliche Folgen der beobachteten Veränderungen näher untersucht werden. The goal of the experimental infection of newborn rats with Borna disease virus (BDV) was to induce lifelong persistency of the virus in the central nervous system, without provoking profound immunopathologic reactions. This should serve as a representative model for the investigation of disruptions in the development and in the function of the brain due to non-zytopathogenic RNA-viruses. In this study we focused on characterizing the impact of the infection by looking at morphological changes in Neurofilaments and other neuronal proteins, as are also seen in the formation of neuropsychiatric diseases. Therefore we chose to non-invasively infect the newborn rats with aerosol containing virus, for the immunotolerance is higher and the inflammatory reactions, which could also lead to neurodegenerative changes are fewer using this route of infection than in the conventional intracerebral infection. We infected newborn Lewis rats and kept a non-infected control group. Sequential slides of the brains were cut and stained with standard and immunohistochemic stains with markers for BDV protein, DISC1 protein and NUDEL protein. Markers for phosphorylated and non- phosphorylated Neurofilaments were used to further investigate the morphological changes in the brain tissue. No clinical signs and no specific immune response, as is typical for a persistent immune-tolerant infection, were found in 12 of the 13 newborn aerosol infected rats (NBAE rats). These rats showed microgliosis and astrocytosis with increased age, also more and more BDV protein was expressed in cells of all regions of the brain. The cell density was within the physiological range in the infected rats up to an age of four weeks. From the 6th week on a reduction of Purkinje cells was noted, which then further decreased up to week 22. Perivascular mini-infiltrates were found in two rats aged six weeks. We assume that these were due to a transient unspecific immune response. A marked lymphocytic inflammatory reaction was detected in one rat aged four weeks. In this animal the infection on the first day of life was not successful and it acquired BDV, probably from an infected and virus-shedding sibling, at an older and thus immunocompetent age leading to an infection. With advanced age of the rats an increased number of alterations in the Neurofilaments were seen. The non-phosphorylated Neurofilaments were less distinct in the infected animals than in the healthy controls.It was possible to distinguish the non-phosphorylated Neurofilaments as dendrites and axons in the older control animals, yet in the infected rats these were only slightly and discontinuously recognizable. In the healthy control animals the phosphorylated Neurofilaments were seen as a subtle hem surrounding the neuron, dendrites and axons were distinct at any age. In contrast, the phosphorylated Neurofilaments of the infected rats formed granulous condensations and aggregations. Here the dendrites and the axons were interrupted and swollen, in many locations comparable to a row of beads. In the controls the DISC1 protein was expressed in the cytoplasm and in the nucleus of the neuron, whereas in the NBAE rats it was only present in the nucleus, this change in the expression pattern of the DISC1 protein was mainly notable in the CA2 sector of the hippocampus. The amount of DISC1 expressing cells, as well as the intensity of the intranuclear expression of the protein was markedly increased in the infected rats. This resulted in a stage of hyper expression of DISC1 in older animals. These results show that BDV infection affects the formation, development and dynamics of the Neurofilaments and thus may have a direct or indirect influence on the expression of DISC1. Further clarification is needed on how the BDV influences the development of the Neurofilaments. It is known that the DISC1 protein has a major impact on the formation, maintenance and stability of the cytoskeleton of the neurons and thus all functions of the brain. Hence one can assume that a change in DISC1 expression can severely influence the development and morphological appearance of the Neurofilaments. Consequently these pathological findings may play a significant role in the neurological disease of neonatal BDV infected rats. In neurodegenerative diseases of humans alterations of the Neurofilaments are frequently seen. The BDV-NBAE rats may thus prove to be a suited model to further understand the pathogenesis of such non-immune mediated, neurodegenerative diseases. To make additional statements about the involvement of BDV infection on the development of neuropsychiatric diseases extent, specificity and possible consequences of the noted changes will have to be further investigated in the future.