Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung caniner Spermien unter besonderer Berücksichtigung verschiedener Verdünner

Abstract

Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung caniner Spermien unter besonderer Berücksichtigung verschiedener Verdünner Die Kryokonservierung von Rüdensperma gewinnt durch den stetig steigenden Einsatz der künstlichen Besamung zunehmend an Bedeutung. Zahlreiche kommerzielle und nicht-kommerzielle Verdünner-Systeme sind bereits beschrieben und verfügbar. Ziel dieser Studie war es, drei verschiedene Verdünner, zwei selbst hergestellte Tris-Eidotter-Verdünner (TE und Uppsala Equex System 2, Up, nach Linde-Forsberg, 2001) sowie den kommerziellen CaniPRO Freeze A& B Verdünner (CP), bezüglich ihrer Eignung für die Kryokonservierung von caninem Sperma sowie für den Einsatz im täglichen Kliniks-Alltag zu untersuchen. Des Weiteren wurde der Zusatz eines Auftaumediums (UpA, Auftaumedium des Uppsala Equex Systems 2 nach Linde-Forsberg, 2001) zur Verbesserung der Spermaqualität untersucht. Mittels digitaler Manipulation wurden 30 Ejakulate fraktioniert von zehn gesunden Rüden verschiedener, großer Rassen sowie 3 Ejakulate von einem Rüden (Sonderfall) mit benigner Prostatahyperplasie, Prostatazysten und chronischer Prostatitis gewonnen. Unmittelbar an die Gewinnung wurde die spermienreiche Fraktion makroskopisch (Volumen, Farbe, Geruch, Konsistenz, Beimengungen), chemisch-physikalisch (pH-Wert) und mikroskopisch untersucht. Die mikroskopische Untersuchung schloss eine Dichtebestimmung mittels SpermaCue® zur Berechnung der Gesamtspermienzahl und eine subjektive Beurteilung von Gesamt- (GM) und Progressivmotilität (PM), Lebend-Tot-Anteil, Anteil morphologisch veränderter Spermien (Eosin-Ausstrich), akrosomalem Status (Spermac®-Färbung) und Membranintegrität (HOS-Test) ein. Ergänzend wurde eine computerassistierte (CASA) Motilitäts- (GMCASA, PMCASA) und Viabilitätsanalyse (SYBR14/PI) mittels SpermVision® (Minitüb) durchgeführt. Die spermienreiche Fraktion wurde in drei Aliquots aufgeteilt und mit einem der drei Verdünner (TE, UP, CP) aufgearbeitet und nach entsprechender Equilibrierung bei 4°C in Midipailletten eingefroren. Unmittelbar vor dem Einfrieren erfolgte eine erneute Untersuchung eines Aliquots, um die Unterschiede zwischen Nativsperma und vollständig aufgearbeitetem Sperma vor Kryokonservierung festzuhalten. Weitere Untersuchungen wurden direkt nach dem Auftauen (60 Sekunden, 37°C) sowie nach 10, 30 und 60 Minuten durchgeführt. Zudem wurde unmittelbar nach dem Auftauen ein Aliquot 1:1 mit Auftaumedium versetzt und ebenso untersucht. Im Nativsperma wurden folgende Befunde erhoben: Gesamtspermienzahl 894,8 ± 150,3 Mio., PM 80,0 ± 4,8 %, GMCASA 78,2 ± 7,9 %, PMCASA 70,6 % (+ 8,0;- 8,7); Lebend-Tot-Anteil 87,7 ± 2,8 %, Viabilität 85,9 ± 5,7 %, morphologisch veränderte Spermien 11,7 ± 4,6 %, Kappenverluste 0,1 % (+ 0,3; 0), nicht aufgerollte Geißel im HOST 4,7 ± 0,1 %.Nach vollständiger Aufarbeitung, jedoch vor Kryokonservierung war in mit CP-aufgearbeiteten Proben die geringste Beeinflussung der Motilitätsparameter, in mit TE-aufgearbeiteten Proben die größte Beeinflussung nachweisbar. Nach der Kryokonservierung war die Motilität in Up-Proben am höchsten (GM 60,5 ± 7,0 %, PM 50,5 ± 13,4 %, GMCASA 50,1 ± 13,9 %, PMCASA 37,0 % (+ 13,8; - 12,8)) verglichen mit CP-verdünnten Ejakulaten (GM 49,8 ± 12,6 %, PM 41,7 ± 15,2 %, GMCASA 28,9 ± 10 % , PMCASA 17,2 % (+ 10,8; - 8,6)) und TE-aufgearbeiteten Proben (GM 32,0 ± 13,3 %, PM 20,4 ± 13,4 %, GMCASA 21,8 ± 5,7 %, PMCASA 10,2 % (+ 6,7; - 5,2)). Die Geschwindigkeits- und Streckenparameter (VSL 48,5 ± 8,2; VCL 93,5 ± 11,6; VAP 58,0 ± 8,7; DSL 20,5 ± 3,4; DCL 39,8 ± 4,7; DAP 24,5 ± 3,6) waren jedoch in CP-Proben am höchsten. Der mittlere Anteil morphologisch veränderter Spermien lag bei 17,2 ± 8,7 % (Up), 14,1 ± 8,4 % (CP) und 19,8 ± 9,6 % (TE).Während der Inkubation bei 37°C waren die Viabilitätsverluste und die Abnahme des Anteils lebender Spermien in mit Up-versetzten Proben am geringsten.Der Zusatz von Auftaumedium führte insbesondere zu einer subjektiven Verbesserung der Motilität, zu höheren Strecken- und Geschwindigkeitsparametern sowie zu einer erhöhten Viabilität (CP, Up).Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte eine deutliche Überlegenheit der zweiphasigen Up- und CP- Verdünner im Vergleich zum einphasigen TE-Verdünner gezeigt werden, was ihren Einsatz im Kliniks-Alltag bei nur geringgradig höherem Zeitaufwand rechtfertigt. Während nach dem Auftauen GM und PM beim Up-Verdünner am höchsten waren, zeichnete sich der CP-Verdünner durch die höchsten Geschwindigkeits- und Streckenparameter sowie den geringsten Anteil an morphologisch veränderten Spermien aus. Welcher dieser Untersuchungsparameter einen entscheidenderen Einfluss auf die Fertilität hat, bedarf weiterer in vivo bzw. in vitro Untersuchungen. Investigations for optimising cryopreservation of canine spermatozoa with special reference to different extendersThe importance of cryopreservation of canine semen has steadily increased by an increased demand for artificial insemination. Various commercial and non-commercial extenders are available. The aim of the present study was to compare three different semen extenders, two self-made tris-egg yolk extenders (TE and Uppsala Equex System 2, Up, according to Linde-Forsberg, 2001) and the commercially available CaniPRO Freeze A&B extender (CP) for cryopreservation of canine semen and their use in every day practice. Furthermore, the use of a thawing medium (Up A, thawing medium of the Uppsala Euqex System 2 according to Linde-Forsberg, 2001) was evaluated for improvement of post-thaw semen quality. Thirty ejaculates from 10 healthy, large breed stud dogs as well as 3 ejaculates from a dog with benign hyperplasia of the prostate, prostatic cysts and chronic prostatitis (special case) were collected fractionatedly by digital manipulation. Immediately after collection, the sperm rich fraction was evaluated macroscopically (volume, colour, odour, consistency, additives), chemical-physically (pH) and microscopically. Microscopical examination included determination of sperm concentration using SpermaCue® for calculation of the total sperm count and a subjective evaluation of total (GM) and progressive motility (PM), live/dead ratio and pathomorphology (eosine smear) including acrosomal structure (Spermac® stain) and membrane integrity (HOS test). In addition, total (GMCASA) and progressive motility (PMCASA) as well as viability (SYBR/PI) were evaluated using the casa system SpermVision (Minitüb, Germany). The sperm rich fraction was divided into three equal aliquots, diluted with one of the respective extenders (TE, CP, Up) and finally frozen in straws after equilibration at 4°C. An examination of an aliquot was performed immediately before freezing to evaluate changes between native and chilled semen. Additional examinations were done immediately after thawing (60 seconds, 37°C) as well as 10, 30 and 60 minutes later. One aliquot of the frozen-thawed sample was mixed with a thawing medium at 1:1 ratio and processed as described before. In native semen, the following results were obtained: total sperm count 894.8 ± 150.3 Mio., PM 80.0 ± 4.8 %, GMCASA 78.2 ± 7.9 %, PMCASA 70.6 % (+ 8.0; - 8.7), % living sperm 87.7 ± 2.8 %, viability 85.9 ± 5.7 %, morphologically abnormal sperm 11.7 ± 4.6 %, acrosomal loss 0.1 % (+ 0.3; 0), HOST: not curled 4,7 ± 0,1 %. After extending but before freezing, lowest influence on motility was observed in CP-samples and biggest in TE-samples. Following cryopreservation, motility in Up-samples was highest (GM 60.5 ± 7.0 %, PM 50.5 ± 13.4 %, GMCASA 50.1 ± 13.9 %, PMCASA 37.0 % (+ 13.8; - 12.8)) compared to CP-samples (GM 49.8 ± 12.6 %, PM 41.7 ± 15.2 %, GMCASA 28.9 ± 10 %, PMCASA 17.2 % (+ 10.8; - 8.6)) and TE-samples (GM 32.0 ± 13.3 %, PM 20.4 ± 13.4 %, GMCASA 21.8 ± 5.7 %, PMCASA 10.2 % (+ 6.7; - 5.2)). However, speed and distance parameters (VSL 48.5 ± 8.2; VCL 93.5 ± 11.6; VAP 58.0 ± 8.7; DSL 20.5 ± 3.4; DCL 39.8 ± 4.7; DAP 24.5 ± 3.6), were highest in CP-samples. In mean, 17.2 ± 8.7 % (Up), 14.1 ± 8.4 % (CP) and 19.8 ± 9.6 % (TE) morphologically abnormal sperm were detected. During incubation at 37°C, the reduction of viability and % of living spermatozoa was lowest in Up-samples compared to the other extenders. The addition of the thawing medium UpA resulted mainly in a subjective improval of the motility, higher speed and distance parameters and increased viability (CP, Up). This study shows that the two-phase Up and CP extenders are significantly better for cryoconservation than the one-phase TE extender that justifies their use during daily practice with an only slightly higher expenditure of time. While motility (GM and PM) after thawing was highest in the Up-samples, the CP-extender was characterised by highest speed and distance parameters as well as the lowest percentage of morphologically abnormal sperm. However, which of these parameters has the highest impact on fertility needs further in vivo and in vitro investigations, respectively.