Immunohistochemical detection of gastrin and motilin peptides, their receptors, VIP receptors and caspase activity from the abomasal wall of cattle

Abstract

ObjectiveThe aim of this study was to examine the possible effects of gastrin, motilin peptides, their receptors and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) receptors on the occurrence of abomasal displacement (AD). A decreased amount of stimulating factors (motilin, motilin receptors) accompanied by an increased amount of inhibiting factors (gastrin, gastrin receptors, VIP receptors) in the abomasal wall could be a cause of the hypo- or atony of the abomasum prior to the abomasal displacement. The caspase-3 activity of the abomasal wall was also examined as apoptosis marker in order to investigate the degree of impairment of the abomasal wall between healthy cows and cows with AD. Material and methodsBiopsies of the corpus abomasi and antrum pylori were available from 20 slaughtered German Holstein cows and from 20 German Fleckvieh cows. Furthermore, material from 20 other German Holstein cows with abomasal displacement as well as biopsies from another three cows of this breed were available. In the latter, an abomasal impaction was experimentally induced by placing a variable gastric band. The paraffin embedded biopsy samples were cut 6µm thick with a microtome for the immunohistochemical investigations. The positive signals were quantified by measuring the stained areas using semiautomatic software program AnalySIS® (Olympus). In this study gastrin and motilin peptides, their receptors, VIP receptors and caspase-3 were stained immunohistochemically (ABC-/AEC-technique).ResultsGastrin was detected only in the tunica mucosa of the antrum. No significant breed difference was found between German Holstein (GH) and German Fleckvieh (GFV) regarding the immunoreactive (IR) area of this gastrointestinal peptide (GFV: 1174 ± 655 µm², GH: 1105 ± 930 µm²). The comparison between GH with abomasal displacement (AD) and without AD, GH cows with AD revealed a larger IR gastrin area (GH with AD: 1277 + 863 µm²). However, this difference was not significant. Gastrin receptors (CCKBR) were detected neither in GH nor in GFV cows in the tunica muscularis of the abomasal wall. Motilin also could not be detected in any layer of the abomasal wall of both breeds contrary to the motilin receptors. In both localizations of the abomasal wall of GFV cows, the IR area for these receptors tended to be larger than in GH cows without AD (antrum: 206 ± 57 µm² vs. 179 ± 53 µm²; corpus: 172 ± 69 vs. 152 ± 52 µm²). No significant differences were found in this regard (p = 0.11). The intra-breed comparison observed significant larger motilin receptor IR areas in GH cows without AD compared to GH cows with AD in both localizations (antrum: 125 ± 55 µm²; corpus: 124 ± 43 µm²; p = 0.003). In GH cows with experimentally induced abomasal impaction, a decrease of the IR area of motilin receptors was detected after placing the gastric band for 72 hours (antrum, 1st OP: 95 ± 46 µm², 2nd OP: 47 ± 8 µm²; corpus, 1st OP: 101 ± 19 µm²; 2nd OP: 80 ± 28 µm²), however this decrease was not significant (p = 0.27). Regarding the number of VPAC1 receptor in the abomasal wall, no inter-breed difference could be detected (antrum: GFV 19 ± 10, GH 18 ± 6; corpus: GFV 19 ± 10, GH 18 ± 8). However, GH cows with AD have a significant higher number of these receptors compared to the healthy cows of this breed (GH with AD antrum: 24 ± 11, corpus: 26 ± 11; p = 0.005). It is also observed that, experimental induction of an abomasal impaction has also increased the number of VPAC1 receptors (antrum, 1st OP: 13 ± 5, 2nd OP: 15 ± 4; corpus, 1st OP: 16 ± 6, 2nd OP: 20 ± 10), however this difference was not significant. Caspase activity, as a criterion for the impairment of the abomasal wall, was significantly higher in GH cows with abomasal displacement compared to healthy GH cows (GH cows with AD antrum: 26 ± 11%, corpus: 29 ± 9%, GH cows without AD antrum: 17 ± 6%, corpus: 21 ± 7%, p = 0.002). The same tendency was also observed in GH cows with experimentally induced AD, however this difference was not significant (p = 0.12). Also no significant difference was detected in the ratio of apoptotic cells between both breeds. ConclusionsThe motilin receptor seems to have an important role in the abomasal motility. Motilin receptors are detected in the tunica muscularis of abomasal wall of all subjects. The tendency that GFV cows have higher amounts of motilin receptors in their abomasal wall, might explain why the cows of this breed are less susceptible to AD. The reduced amounts of motilin receptors in the GH cows with AD and experimentally induced abomasal impaction, in comparison to the healthy GH cows, indicates that AD could cause mechanical destruction of these receptors due to the mechanical stretching or hypoxia of the abomasal wall, to which the increase of the caspase activity could provide evidence.Gastrin seems not to be involved in the occurrence of AD. The absence of the gastrin receptors in the abomasal wall found in this study supports this finding.A lower amount of motilin receptors and a higher amount of VPAC1 receptors in GH cows with AD, compared to healthy GH cows, could be an explanation for the occurrence of AD in these cows. However, according to the results gathered from the subjects with artificially induced abomasal impaction indicates that these changes were likely a consequence of AD itself, rather than being a cause of it. Zielsetzung der StudieDas Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung von Gastrin und Motilin, sowie deren Rezeptoren und Vasoaktives-Intestinales-Polypeptid Rezeptoren beim Auftreten von Labmagenverlagerungen (LMV) zu untersuchen. Eine reduzierte Zahl stimulierender Faktoren und eine erhöhte Zahl inhibitorischer Faktoren in der Labmagenwand könnte eine Ursache für die Hypo- oder Atonie des Labmagens vor einer LMV sein. Caspase 3 -als Apoptose-Marker- wurde zur Einschätzung des Schädigungsgrades der Labmagenwand bestimmt und zwischen den gesunden Kühen und solchen mit LMV verglichen. Material und MethodeZur Untersuchung standen Gewebeproben von jeweils 20 gesunden Kühen der Rassen Deutsches Fleckvieh und Deutsche Holsteins zur Verfügung. Ebenso konnte auf Material von 20 Deutschen Holstein-Kühen mit Labmagenverlagerung sowie auf Gewebeproben von drei weiteren Kühen dieser Rasse zurückgegriffen werden, bei denen experimentell durch Anlegen eines Magenbandes - eine Labmagendilatation induziert wurde. Die in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurden für die immunhistologischen Untersuchungen in 6 µm dicke Schnitte aufgearbeitet. Die dargestellten Peptide wurden quantifiziert, indem die angefärbten Flächen und Zellen unter Verwendung des halbautomatischen Softwareprogramms AnalySIS® (Olympus) ausgemessen wurden. Berücksichtigt wurden in dieser Studie die Peptide Gastrin und Motilin und deren Rezeptoren sowie zusätzlich der Vasoaktives Intestinales Polypeptid Rezeptor-1 (VIPR1) und die Caspase Aktivität. Für die immunhistochemischen Untersuchungen kam ein indirektes Verfahren mit der ABC-/ AEC-Methode zur Anwendung.ErgebnisseGastrin konnte nur in der Mukosa des Antrumbereichs dargestellt werden. Bezüglich der immunreaktiven Fläche für diesen Neurotransmitter ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Rassen Deutsches Fleckvieh (DFV) und Deutsche Holsteins (DH) (DFV: 1174 ± 655 µm², DH: 1105 ± 930 µm²). Im Vergleich zwischen Deutschen Holsteins mit Labmagenverlagerung (LMV) und solchen ohne diese Erkrankung hatten erstere eine größere IR-Gastrin-Fläche (DH mit LMV 1277 ± 863 µm²). Dieser Unterschied war allerdings nicht signifikant. Gastrin-Rezeptoren (CCKBR) konnten weder beim DFV noch bei den DH in der glatten Muskulatur der Labmagenwand nachgewiesen werden.Motilin konnte bei keiner Kuh in irgendeinem Bereich des Labmagens dargestellt werden im Gegensatz zu den Motilin-Rezeptoren. Hierbei erwies sich die IR-Fläche für diese Rezeptoren bei den DFV-Kühen in beiden Lokalisationen des Labmagens tendenziell größer als bei den Deutschen Holsteins ohne LMV (Antrum: 206 ± 57 µm² vs. 179 ± 53 µm²; Corpus: 172 ± 69 vs. 152 ± 52 µm²); signifikante Unterschiede konnten diesbezüglich jedoch nicht nachgewiesen werden (p = 0,11). Innerhalb der Rasse Deutsche Holsteins hatten Kühe ohne LMV an beiden Lokalisationen eine signifikant größere IR-Fläche an Motilin-Rezeptoren, als dies bei den Tieren mit LMV der Fall war (Antrum: 125 ± 55 µm²; Corpus: 124 ± 43 µm²; p = 0,003). Bei den drei DH-Versuchskühen mit experimentell induzierter Labmagen¬dilatation kam es in Zusammenhang mit der Dehnung der Labmagenwand innerhalb von 72 Stunden zu einer Abnahme der IR-Flächen für die Motilin-Rezeptoren (Antrum, 1. OP: 95 ± 46 µm², 2. OP: 47 ± 8 µm²; Corpus, 1. OP: 101 ± 19 µm²; 2.OP: 80 ± 28 µm²). Allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant (p = 0,27).Bezüglich der Anzahl der VIP1-Rezeptoren in der Labmagenwand ergaben sich keine Rassenunterschiede (Antrum: DFV 19 ± 10, DH 18 ± 6; Corpus: DFV 19 ± 10, DH 18 ± 8). Allerdings lag bei den DH-Kühen mit LMV deren Anzahl im Vergleich zu den gesunden Probanden dieser Rasse, signifikant höher (DH mit LMV Antrum: 24 ± 11 Corpus: 26 ± 11; p = 0,005).Es war auch festzustellen, dass die experimentelle Induktion einer Labmagenanschoppung mit einem Anstieg der Anzahl an VIP-Rezeptoren verbunden war (Antrum, 1. OP: 13 ± 5, 2. OP: 15 ± 4, Corpus, 1. OP: 16 ± 6, 2. OP: 20 ± 10). Allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant.Die Caspase-Aktivität, als Kriterium einer Schädigung der Labmagenwand, war bei den Kühen mit Labmagenverlagerung - im Vergleich zu den gesunden Kontrollkühen signifikant erhöht (DH ohne LMV Antrum: 17 ± 6 %, Corpus: 21 ± 7 %; DH mit LMV Antrum: 26 ± 11 %, Corpus: 29 ± 9 %; p = 0,002). Bezüglich des Rassenvergleiches ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Rassen Deutsches Fleckvieh und Deutsche Holsteins.SchlussfolgerungenDem Motilin-Rezeptor scheint bei der Motilität des Labmagens eine wichtige Bedeutung zuzukommen. So konnten auch in diesen Untersuchungen in allen Proben Motilin-Rezeptoren in der Labmagenwand nachgewiesen werden. Die tendenziell größere Dichte an Motilin-Rezeptoren bei den DFV-Kühen könnte erklären, warum Kühe dieser Rasse weniger häufig an Labmagenverlagerung erkranken. Die bei den Holstein-Kühen mit Labmagenverlagerung bzw. mit induzierter Labmagenanschoppung im Vergleich zu den gesunden Probanden dieser Rasse - nochmals reduzierte Zahl an Motilin-Rezeptoren dürfte auf eine mechanische Zerstörung dieser Rezeptoren im Zuge des Krankheitsgeschehens zurückzuführen sein, wozu die Erhöhung der Caspase-Aktivität einen Hinweis liefern könnte.Gastrin scheint keinen direkten Effekt auf die Labmagenverlagerung zu haben. Die Abwesenheit der Gastrin-Rezeptoren in der Labmagenwand ist im Einklang mit diesem Ergebnis.Eine reduzierte Zahl an Motilin-Rezeptoren und erhöhte Zahl an VIP1-Rezeptoren bei den Holstein-Kühen mit LMV - im Vergleich zu den gesunden Probanden dieser Rasse könnte eine Erklärung für das Auftreten einer Labmagenverlagerung liefern. Die Ergebnisse der Untersuchungen an Probanden mit einer expeimentell induzierten Labmagenanschoppung deuten jedoch darauf hin, dass es sich bei den ermittelten Unterschieden zwischen gesunden Holstein-Kühen und solchen mit einer Labmagenverlagerung eher um eine Folge der Verlagerung als um deren Ursache handelt.