Hochauflösende Ultraschall-Analyse der Proliferation und Zystenbildung von Endometrioseherden im Mausmodell

Abstract

Die Endometriose ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankungen beim Menschen, die etwa 8-10% aller Frauen im reproduktionsfähigen Alter betrifft. Um die Pathogenese der Endometriose untersuchen und neue Medikamente präklinisch testen zu können, sind geeignete Kleintiermodelle notwendig. In vielen Nagerstudien werden intraperitoneale Endometrioseherde chirurgisch durch Transplantation von Uterusstanzen in die Bauchhöhle induziert. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal ein hochauflösendes Ultraschallsystem für die repetitive in vivo Analyse solcher Endometrioseherde in Mäusen eingeführt.Zur Induktion intraperitonealer Endometrioseherde wurden isolierte Uterusstanzen in die Bauchhöhle von C57BL/6-Mäusen transplantiert. Je nach Versuchsgruppe wurden die Uterusstanzen autolog oder syngen transplantiert. Da diese sowohl aus Endometrium als auch Myometrium und Perimetrium bestanden, wurde untersucht, welchen Einfluss diese Gewebeschichten sowie die Größe und subperitoneale Lage der transplantierten Uterusstanzen auf das Wachstumsverhalten der sich daraus entwickelnden Endometrioseherde haben. Die Endometrioseherde sämtlicher Gruppen wurden am Tag der Transplantation der Uterusstanzen (Tag 0) sowie am 7., 14., 21. und 28. Tag mit dem hochauflösenden Ultraschallsystem Vevo770 analysiert. Am Ende des Beobachtungszeitraums wurden die Endometrioseherde mit dem Messschieber ausgemessen und im Anschluss für Histologieauswertungen entnommen. Zusätzlich erfolgte die Induktion von Herden, die am 3. und 7. Tag mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie und Immunhistochemie analysiert wurden.Mit der hochauflösenden Ultraschalltechnik war es leicht möglich, intra-peritoneale Endometrioseherde repetitiv und nicht-invasiv zu detektieren und dabei erstmals Stroma- und Zystenanteile der Herde zu differenzieren. Die Volumenmessungen der Endometrioseherde mit Hilfe des Ultraschallsystems korrelierten sehr gut mit den Ergebnissen herkömmlicher Messmethoden. Weiterhin war sowohl die Intra- als auch die Interobserver-Variabilität der Volumenmessungen mittels Ultraschallbildgebung gering. Endometrioseherde, die sich aus syngen oder autolog transplantierten Uterusstanzen in die Bauchhöhle von C57BL/6-Mäusen entwickelten, wiesen unabhängig vom Transplantationsmodus ein vergleichbares Wachstum auf. Allerdings wirkte sich die initiale räumliche Orientierung der transplantierten Uterusstanzen unmittelbar auf die Ausbildung der Herde aus. So wiesen Herde, die sich aus Uterusstanzen entwickeln, deren Perimetrium an das Peritoneum der Bauchwand fixiert wurde, ein signifikant gesteigertes Wachstum im Vergleich zu Uterusstanzen auf, deren Endometrium an der Bauchwand anlag. Dies ging mit einer signifikant erhöhten Anzahl PCNA- und CD31-positiver Zellen in diesen Herden einher, wobei PCNA die proliferierenden Zellen und CD31 Gefäßendothelzellen färbt. Weiterhin hatten Endometrioseherde, die sich aus 3mm-Uterusstanzen entwickelten, im Vergleich zu Herden, die sich aus 2mm-Uterus-stanzen entwickelten, über den gesamten Untersuchungszeitraum ein größeres Herdvolumen. Ihr prozentuales Wachstum war jedoch im Vergleich zu den Herden der 2mm-Uterusstanzen deutlich reduziert. Subperitoneale Endometrioseherde wiesen im Vergleich zu intraperitonealen Herden ein homogeneres und gesteigertes Wachstumsverhalten auf. In ovarektomierten und Danazol-behandelten Mäusen regredierten die subperitonealen Endometrioseherde über den Untersuchungszeitraum. Danazol inhibiert die GnRH-Ausschüttung wodurch folglich der Östrogenspiegel im Blut fällt. Dies zeigt, dass auch die subperitonealen Endometrioseherde hormonabhängig sind.Mit dem hochauflösenden Ultraschallsystem Vevo770 ist es erstmals möglich, sowohl das Proliferations- als auch Sekretionsverhalten von Endometrioseherden in der Bauchhöhle von Mäusen repetitiv zu untersuchen. Durch die Nicht-Invasivität dieses Verfahrens müssen zu den einzelnen Versuchszeitpunkten keine Tiere für Endpunktanalysen der Herde getötet werden. Entsprechend trägt die hochauflösende Ultraschallbildgebung dazu bei, die für zukünftige tierexperimentelle Studien benötigten Tierzahlen maßgeblich zu reduzieren. Weiterhin konnte erstmals das Wachstumsverhalten subperitonealer Endometrioseherde analysiert werden. Dabei wurde gezeigt, dass sich subperitoneale Endometrioseherde im Vergleich zu konventionellen intraperitonealen Herden durch ein homogeneres, hormonabhängiges Wachstumsverhalten auszeichnen. Zusammenfassend konnten somit in der vorliegenden Arbeit mit der hochauflösenden Ultraschalldiagnostik und dem subperitonealen Endometriosemodell zwei neue wissenschaftliche Methoden in die Endometrioseforschung eingeführt werden, die zukünftig nicht nur neue Einblicke in die Pathogenese der Erkrankung ermöglichen, sondern auch zur Entwicklung neuer Therapiekonzepte einen wichtigen Beitrag leisten können. Endometriosis is a frequent gynecological disease in humans, which affects ~8-10% of women in reproductive age. To analyze the mechanisms involved in the pathogenesis of endometriosis and to identify new molecular targets for the development of effective therapies, small animal models are an important approach. In many rodent studies, intraperitoneal endometriotic lesions are surgically induced by transplantation of uterine tissue samples into the abdominal cavity. In the present study, high-resolution ultrasound imaging was introduced for the first time for the repetitive in vivo analysis of such endometriotic lesions in mice.Intraperitoneal endometriotic lesions were surgically induced by syngeneic or autologous uterine tissue transplantation into the peritoneal cavity of C57BL/6 mice. The tissue samples did not only consist of endometrium, but also of myometrium and perimetrium of the uterus wall. Thus, it was analyzed how the spatial orientation of the transplants affects the establishment of endometriotic lesions. Moreover, the influence of the size and the subperitoneal position of transplanted uterine tissue samples was analyzed as crucial determinants of endometriotic lesion growth. The volume of developing lesions, their stroma and cysts were measured by means of the high-resolution ultrasonography system Vevo770 directly after transplantation as well as at days 7, 14, 21 and 28. At the end of the experiments, the animals were laparotomized for volume measurement of the endometriotic lesions by means of a caliper and histology. Additionally, endometriotic lesions were analyzed by means of intravital fluorescence microscopy and immunohistochemistry at days 3 and 7 after tissue transplantation.The non-invasive sonography technology allowed for the repetitive and quantitative analysis of endometriotic lesion growth with a low intra- and interobserver variability. Moreover, it enabled the differentiation between endometrial cysts and stroma. The results of the sonography analyses correlated well with the measurements of lesion volume by caliper and histology. The mode of transplantation of uterine tissue samples did not affect the engraftment and development of endometriotic lesions. However, the establishment of endometriotic lesions was dependent on the spatial orientation of the transplants. In fact, lesion growth was increased when the perimetrium was sutured to the peritoneum. This was associated with an increased number of proliferating stromal and glandular cells within the lesions. Furthermore, endometriotic lesions, which developed from 2mm uterine tissue samples, exhibited a higher growth rate when compared to lesions originating from 3mm tissue samples. Furthermore, in the present thesis the growth behaviour of subperitoneal endometriotic lesions could be analyzed for the first time by means of ultrasound imaging. Subperitoneal lesions showed a homogeneous and increased growth rate compared to intraperitoneal endometriotic lesions. Ovariectomy and danazol treatment induced a regression of subperitoneally implanted lesions, indicating an hormone-dependent lesion growth.The results showed that high-resolution sonography is a reliable and easily applicable method for the repetitive analysis of intraperitoneal endometriosis in small laboratory animal models. This non-invasive technology allows for the first time detailed qualitative and quantitative analyses of growth, cyst development and adhesion formation of endometriotic lesions. Due to the non-invasiveness of ultrasonography, it is not necessary to sacrifice mice at different observation time points. Accordingly, the number of mice used in an experiment can be substantially reduced in future studies. Taken together, high-resolution ultrasound imaging represents a versatile tool in preclinical endometriosis research, not only to gain new insights into the pathophysiology of the disease, but also to develop future treatment strategies.