Entwicklung und Validierung eines fluoreszenzmikroskopischen Schnellnachweisverfahrens für lebensfähige Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) Zellen in Milch und Säuglingsanfangsnahrung

Abstract

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der kausale Erreger der Paratuberkulose der Wiederkäuer. Seit 1913 wird in der Fachliteratur eine Mitbeteiligung von MAP an der Entstehung von Morbus Crohn, einer chronischen Darmentzündung beim Menschen, kontrovers diskutiert. Neben direktem Kontakt zu mit MAP infizierten Tieren ist eine Exposition des Menschen gegenüber MAP über Lebensmittel tierischer und pflanzlicher Herkunft sowie Wasser möglich. Im Fokus stehen insbesondere Milch und Milchprodukte, bei denen MAP bei einer Vielzahl von Untersuchungen nachgewiesen werden konnte (Anonymous, 2010; Grant, 2010; Slana et al., 2008a). Derzeit gibt es keine ideale Methode zum Nachweis von MAP-Zellen in einer Probe. Um eine exakte Bestimmung der Anzahl lebensfähiger MAP-Zellen gewährleisten zu können, ist die Entwicklung neuer Nachweismethoden notwendig (Anonymous, 2010). Das Ziel dieser Doktorarbeit bestand deshalb in der Entwicklung einer einfachen, schnellen und kostengünstigen fluoreszenzmikroskopischen Methode zum Nachweis lebensfähiger MAP-Zellen in Milch und Milchprodukten. Durch die Kombination aus CTC- (5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)-Tetrazolium Chlorid) und Auramin Orange (AO)-Färbung kann sowohl die Gesamtzellzahl an Mykobakterien als auch differenziert der Anteil respiratorisch aktiver Zellen in einer Probe in nur acht bis neun Stunden erfasst werden. Die Nachweisgrenze für die kombinierte CTC-/AO-Färbung lag bei 7,4 x 102 KbE/ml für artifiziell kontaminiertes FPTB-Medium Plus, bei 7,8 x 102 KbE/ml für artifiziell kontaminierte H-Milch und bei 3,8 x 103 KbE/ml für artifiziell kontaminierte Rohmilch (Nachweiswahrscheinlichkeit 95 %). Die CTC-/AO-Färbung eignet sich insbesondere für den Einsatz bei wissenschaftlichen Einmischversuchen zur Ermittlung der Einmischkonzentration. Dabei kann diese neue Methode als Ersatzmethode zur langwierigen kulturellen Anzucht dienen, sofern die Ausgangskonzentration der MAP-Zellen über 103 KbE/ml liegt. Um eine Exposition von Säuglingen mit MAP über Nahrungsmittel besser abschätzen zu können, wurde ein repräsentatives Spektrum an Säuglingsanfangsnahrungsmitteln ( Pre und HA Pre ) aus dem deutschen Handel mittels kultureller Anzucht auf Herrold s Egg Yolk-Medium, FASTPlaqueTB -Assay und TaqMan®-Real-Time PCR* untersucht. Bei keinem der 16 untersuchten Produkte konnten MAP-Zellen nachgewiesen werden Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of paratuberculosis of ruminants. Since 1913 there is a controversial discussion in the scientific literature whether MAP is involved in the pathogenesis of Crohn s disease, which is a chronic enteritis of humans. In addition to direct contact to MAP infected animals, humans may be exposed to MAP by consumption of contaminated food products and water. An increasing number of studies have been focused on milk and dairy products in which MAP has been detected in many cases (Anonymous, 2010; Grant, 2010; Slana et al., 2008a). It has been stated, that current methods for the detection of MAP cells in a sample have significant limitations. In order to accurately determine the number of viable MAP cells, new detection methods have to be developed (Anonymous, 2010).The aim of the present study was to develop a simple, rapid and economic fluorescence staining method for the detection of viable MAP cells in milk and dairy products. The combination of 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) and auramine orange (AO) staining provides the opportunity to determine the total cell number as well as the number of respiratory active cells in a sample within eight to nine hours. The detection limit of the combined CTC-/AO staining was 7.4 x 102 CFU/ml for spiked FPTB-Medium Plus, 7.8 x 102 CFU/ml for spiked pasteurized milk and 3.8 x 103 CFU/ml for spiked raw milk (probability of detection 95 %). The combined CTC-/AO staining could be used especially in spiking experiments for scientific purposes to determine the initial spiking concentration. This new method could be used instead of time-consuming culture methods, unless the initial MAP-concentration for spiking is above 103 CFU/ml.To provide a better risk assessment whether infants are exposed to MAP by consumption of infant milk, a representative spectrum of powdered infant milk from German retail level ( pre and HA pre ) have been examined by culture on Herrold s Egg Yolk-Medium, FASTPlaqueTB -Assay and TaqMan®-Real-Time PCR*. In none of the 16 examined products, MAP cells have been detected.