Einfluss von Hypoxie/Reoxygenierung auf die TGFbeta-Freisetzung & Signalwege in mikrovaskulären Endothelzellen

Abstract

Der Transfroming Growth Factor beta (TGFbeta) spielt als Wachstumsfaktor bei pathophysiologischen Umbauprozessen, dem kardialen Remodelling, eine entscheidende Rolle. Das kardiale Remodelling beschreibt Veränderungen des Herzens in Bezug auf Form, Größe und Funktionalität und ist ein entscheidender Schritt bei der Entstehung einer Herzinsuffizienz. Die Beteilung von TGFbeta an Komponenten des Remodellings, z.B. der Apoptose in Kardiomyozyten, ist in vorangegangenen Studien bereits gut erforscht. In dieser Arbeit konnten Endothelzellen als Quelle einer TGFbeta-Freisetzung und -Erhöhung, induziert durch Hypoxie und Reoxygenierung, identifiziert werden. Nach Simulation eines Myokard-Infarkts durch Hypoxie und anschließender Reoxygenierung konnte eine vermehrte TGFbeta-Expression auf Proteinebene, sowie mRNA-Ebene in mikrovaskulären Endothelzellen des Herzens gezeigt werden. Zu bekannten intrazellulären Signalmolekülen von TGFbeta gehören die SMAD-Moleküle (Small mothers against decapentaplegic). In der vorliegenden Arbeit konnte induziert durch Hypoxie und Reoxygenierung eine vermehrte Expression von SMAD2, SMAD3, und SMAD7 sowie eine Aktivierung des Rezeptor-abhängigen SMAD2 durch Phosphorylierung in Endothelzellen gezeigt werden. Da R-SMADs durch eine Liganden-Rezeptorbindung an der äußeren Zellmembran phosphoryliert werden, lässt dies auf eine Hypoxie/Reoxygenierung induzierte TGFbeta-Freisetzung schließen. Durch Einsetzen eines TGFbeta-Rezeptor-Inhibitors TypI konnte die Aktivierung der SMADs vermindert werden. Zu bekannten Interaktionspartnern von SMADs zählen Mitglieder der GATA Familie. Es existieren 6 Isoformen, von denen jedoch nur GATA2, 4 und 6 in Endothelzellen exprimiert werden. GATA4 wird nur minimal in Endothelzellen exprimiert, weshalb in vorliegender Arbeit lediglich eine Hypoxie/Reoxygenierung induzierte Expression von GATA2 und 6 untersucht wurde. Es konnte eine vermehrte GATA2 Bindungsaktivität nach 4 Stunden Reoxygenierung gezeigt werden. Ein bekanntes Zielgen von GATA2 stellt die mikroRNA24 dar. MikroRNAs sind kleine, nicht kodierende RNAs, welche in annähernd jedem Zelltyp gebildet werden und eine entscheidende Rolle in der kardiovaskulären Pathophysiologie einnehmen. Bei der Analyse verschiedener MikroRNA-Isoformen konnte eine vermehrte Expression von mikroRNA21 und mikroRNA24 24 Stunden nach Reoxygenierung gezeigt werden. Durch Einsetzen des TGFbeta-Rezeptor-Inhibitors konnte der Effekt deutlich gemindert werden, was zeigt, dass es sich um einen TGFbeta vemittelten Vorgang handeln muss. Die Wirkungen von mikroRNA21 und 24 werden im Zusammenhang mit pro-apoptotischen und anti-angiogenetischen Prozessen am Herzen diskutiert und könnten somit Vorgänge des kardialen Remodelling beeinflussen. Neben autokrinen Effekten konnten parakrine Auswirkungen auf Kardiomyozyten beobachtet werden. Das während Hypoxie/Reoxygenierung aus Endothelzellen freigesetzte TGFbeta aktiviert parakrin in Kardiomyozyten SMADs und löst Apoptose aus. Somit ist es gelungen, TGFbeta-induzierte Signalwege in hypoxen und reoxygenierten Endothelzellen und deren parakrine Wirkung auf Kardiomyozyten darzustellen.Dies kann zum besseren Verständnis von Vorgängen des kardialen Remodellings nach einem Infarkt beitragen und neue Perspektiven für therapeutische Ansätze bieten. Transforming growth factor beta (TGFbeta) plays a critical role in cardiac remodelling. Cardiac Remodelling includes alterations of shape, dimension and functionality of heart and describes a critical step in the development of heart failure. Recent studies showed the involvement of TGFbeta in cardiomyocytes in cardiac remodeling, especially in apoptosis induction. In this study, we identified endothelial cells as source of hypoxia/reoxygenation-induced TGFbeta expression. Simulation of myocardial infarction by hypoxia and reoxygenation increased TGFbeta protein and mRNA expression in cardiac microvascular endothelial cells. Intracellular signal transduction by TGFbeta is mediated by SMAD molecules (small mothers against decapentaplegic). In this study we showed a hypoxia/reoxygenation-induced increase of SMAD2, SMAD3 and SMAD7 as well as activation of receptor-dependent SMAD2 (R-SMAD2) by phosphorylation in endothelial cells. Phosphorylation of R-SMAD2 was mediated by TGFbeta binding to transmembrane receptors, because the effect of SMAD activation could be abolished by inhibition of the TGFbeta receptor. Since well known interaction partners of SMADs are members of GATA family, induction of GATA members was analysed. 6 isoforms of GATA are known, but only GATA 2, 4 and 6 are expressed in endothelial cells. We could show an increase of GATA2 binding activity after 4 hours of reoxygenation. MicroRNA24 is an established target of GATA2. MicroRNAs are small, non coding RNAs. They are expressed in nearly every cell type and play a key role in cardiovascular pathophysiology. Examination of different microRNAs showed an increase of microRNA21 as well as microRNA24 after 24 hours of reoxygenation. Using TGFbeta receptor inhibitors resulted in distinct abolishment of the effect which demonstrates a TGFbeta-mediated microRNA increase. The effects of microRNA21 and 24 are discussed in the context with pro-apoptotic and anti-angiogenic processes in the heart and may thus be involved in cardiac remodelling after myocardial infarction. Beside the autocrine TGFbeta effects in endothelial cells, we identified a paracrine effect of TGFbeta, when cardiomyocytes were incubated with conditioned medium of hypoxia and reoxygenated endothelial cells. Thus, TGFbeta signaling cascades and target genes could be identified under hypoxia and reoxygenated conditions in endothelial cells, as well as paracrine action on cardiomyocytes, which both may contribute to cardiac remodeling.