STIM1-regulierter Ca2+-Einstrom durch die apikale und die basolaterale Membran im Kolonepithel

Abstract

In nichterregbaren Zellen spielt der speichergesteuerte Ca2+-Einstrom die wichtigste Rolle beim Ca2+-Einstrom aus dem Extrazellulärraum für Ca2+-abhängige Signalprozesse. Ziel der Untersuchungen war es, die Expression und die lokale Verteilung von zwei Schlüsselproteinen (STIM1 und Orai1), die in Lymphozyten und anderen Zellen als Komponenten des speichergesteuerten Ca2+-Einstroms identifiziert wurden, an einem nativen Epithel, dem Kolon der Ratte, nachzuweisen. STIM1 (stromal interaction molecule 1) ist der mutmaßliche Ca2+-Sensor im endoplasmatischen Retikulum und Orai1 gilt als der oder Teil des speichergesteuerten Ca2+-Kanals in der Plasmamembran.Immunhistochemische Markierungen zeigten, dass beide Proteine im Kolonepithel der Ratte exprimiert werden. Qualitative Untersuchungen und morphometrische Messungen mittels eines Konfokalmikroskops ergaben, dass es nach Ca2+-Speicher-Entleerung zu einer Translokation von STIM1 zum basolateralen und auch zum apikalen Zellpol kommt. Ein Ca2+-Entleerung/Wiederfüllung-Protokoll wurde in Ussingkammer-Experimenten eingesetzt, um die Rolle des speichergesteuerten Ca2+-Einstroms über die basolaterale und die apikale Membran zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass nicht nur basolaterale Ca2+-Repletion, sondern auch apikale Ca2+-Repletion eine (wenn auch schwächere) Ca2+-abhängige Anionsekretion induziert. Beide Reaktionen wurden durch La3+, einen Blocker nichtselektiver Kationenkanäle, unterdrückt. Der Effekt der basolateralen Ca2+-Repletion wurde signifikant durch Brefeldin A gehemmt, eine Substanz, die den vesikulären Transport vom endoplasmatischem Retikulum zum Golgi-Apparat hemmt. In einer letzten Versuchsserie wurden mit Fura-2 aufgeladene HT29/B6-Zellen verwendet. Der durch Carbachol an diesen Zellen ausgelöste Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration wurde signifikant gehemmt, wenn die Zellen mit siRNA gegen STIM1 vorinkubiert worden waren.Diese Ergebnisse zeigen, dass STIM1 als eine Schlüsselkomponente von intrazellulären Ca2+ Signalwegen im Kolonepithel der Ratte exprimiert wird und nicht nur bei der Regulation des basolateralen, sondern auch des apikalen Ca2+-Einstroms beteiligt ist. In non-excitable cells, store-operated Ca2+ entry is the most important pathway for influx of extracellular Ca2+ serving as second messenger in the cytoplasm. The present study aimed to investigate the expression, localization and polar distribution of two key components of store-operated Ca2+ entry identified e.g. in lymphocytes or epithelial cell lines, i.e. STIM1 (stromal interaction molecule 1), the presumed Ca2+-sensor in the endoplasmic reticulum, and Orai1 as the (or part of the) store-operated Ca2+ channel in the plasma membrane, at a native intestinal epithelium, i.e. rat colon.Immunohistochemical investigations revealed the expression of STIM1 and Orai1, and also their isoforms STIM2, Orai2, and Orai3 in the rat colonic epithelium. Ca2+ store depletion led to a translocation of STIM1 both to the basolateral as well as to the apical cell pole as observed by confocal microscopy. A Ca2+ depletion/repletion protocol was used in Ussing chamber experiments to investigate the contribution of basolateral and apical store-operated Ca2+ entry for the induction of anion secretion. These experiments revealed that not only basolateral Ca2+ repletion induced a Ca2+-dependent anion secretion, but also to a lesser extend apical Ca2+ repletion. Both responses were suppressed by La3+. The effect of basolateral Ca2+ repletion was significantly inhibited by brefeldin A, a blocker of vesicular transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. In a final series of experiments, fura-2 loaded HT29/B6 cells were used. Carbachol-induced increase in the cytosolic Ca2+ concentration was significantly reduced when the cells were pretreated with siRNA against STIM1.In conclusion, these results demonstrate that STIM1 as a key component of intracellular Ca2+ signaling is expressed by rat colonic epithelium and is involved not only in regulation of basolateral but also of apical Ca2+ influx.