Apoptosis induction by Ochratoxin A, LPS, TNF-alpha, H2O2, and uv light in cultured primary rat hepatocytes, in immortalized rat liver cells and in human hepatoma cells and the prevention by Silibinin

Abstract

In this thesis, I showed that liver cell apoptosis by the mycotoxin ochratoxin Ain vitro is not mediated by cytokine TNF-alpha nor by direct binding to thereceptor TNFR1, but by oxygen radical formation that causes lipid peroxidationand was, thus, different from in vivo conditions in the intact rat liver. TNF-alpha produces apoptosis in liver cells via the extrinsic apoptosis pathway by usingTNFR1 and causes oxidative damage. However, OTA seems to cause apoptosisnot by activating the extrinsic pathway, but, rather the intrinsic pathway. Theherbal flavanolignan silibinin counteracted the cytotoxicity and induction ofapoptosis by OTA, TNF-alpha, H2O2, and UVC on primary rat hepatocytes culturesand thus was a potent cytoprotective and anti-apoptotic agent. Thisdistinguishes silibinin as a prophylactic hepatoprotective remedy. Primäre Hepatozyten aus Ratten wurden nach zwei verschiedenen Methoden isoliert: der klassischen enzymatischen Methode nach künstlicher Verdauung durch Kollagenase-Perfusion und einer neuen EDTA-Perfusionsmethode. Die EDTA-Perfusionsmethode ergab Hepatozyten, die in Zellkulturen bis zu 96 h stabil ohne DNA-Fragmentierung kultiviert wurden, während die Kollagenase präparierten Hepatozyten Apoptoseereignisse bereits von Beginn ihres Kultivierung auch in Abwesenheit von OTA zeigten. Experimentell wurde Apoptose durch 20 ng/ml Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) nur in Gegenwart von 200 ng/ml des transkriptionellen Inhibitors Actinomycin D (ActD) ausgelöst. Diese Apoptosewirkung wurde vollständig in Gegenwart von 25 µg/ml löslichem TNF-alpha-Rezeptor 1 (sTNFR1) verhindert. Der transkriptionelle Inhibitor Actinomycin D (ActD) verursachte alleine keine Apoptose. Die durch ActD/TNF-alpha ausgelöste Apoptose wurde dagegen nicht in Gegenwart von 25-375 µg/ml löslichem TNF-alpha Rezeptor 2 (sTNFR2) im Überstand von Zellkulturen verhindert. Dies zeigt, dass die TNF-alpha-erzeugte Apoptose in kultivierten Hepatocyten nur durch TNFR1 vermittelt wird. Apoptose trat auch nach Anwendung von 12,5 müM Ochratoxin A (OTA) sowhol in kultivierten Hepatozyten als auch in HepG2-Zellen auf. Allerdings wurde diese weder von sTNFR1 bis 500 µg/ml noch von sTNFR2 bis zu 375 µg/ml verhindert. Dies zeigt, dass TNFR1 und 2 an der OTA vermittelten Apoptose in kultivierten Hepatozyten nicht beteiligt sind. Eine Inkubation von kultivierten Hepatozyten und HepG2 Zellen mit dem klassischen TNF-alpha Induktor Lipopolysaccharid (LPS) (von 0,1 bis 12,5 µg/ml) hatte keine cytotoxische oder apoptotische Wirkung unter diesen Bedingungen. Das antioxidative Flavanolignan Silibinin in Dosen von 130 bis 260 müM verhinderte an den Zellkulturen eine Chromatin-Kondensation, Caspase-3-Aktivierung und apoptotische DNA-Fragmentierung, die durch OTA sowie durch 10 mM Wasserstoffperoxid (H2O2), durch ultraviolettes (UVC) Licht (50 mJ/cm2) und durch ActD/TNF-alpha induziert wurden. Um eine Schutzwirkung durch Silibinin zu erreichen, wurde das Medikament zu den Hepatozyten für 2 h im voraus gegeben. Als Verursacher der OTA stimulierten Apoptose wird keine TNF-alpha vermittelte Apoptose, sondern eine durch Lipidperoxidation ausgelöste Apoptose angenommen. Unter OTA trat an den kultivierten menschlichen Lebertumorzellen HepG2 sowie an immortalisierten Rattenleber HPCT-Tumorzellen eine Sauerstoffradikal- und Malondialdehyd (MDA)-Bildung auf. Dieser Indikator für die Lipidperoxidation trat auch durch H2O2 und ActD/TNF-alpha Inkubation auf. Sämtliche oxidativen Reaktionen, nämlich ROS (reactive oxygen species) und MDA wurden durch Silibinin Vorbehandlung unterdrückt. Wir folgern, dass die anti-apoptotische Aktivität von Silibinin gegen OTA, H2O2 und ActD/TNF-alpha durch die antioxidativen Wirkungen des Flavanolignans verursacht wird. Neben der Apoptose-Schutzwirkung vermittelte Silibinin auch einen Schutz vor Zytotoxizität. Dieser wurde gegenüber allen pro-apoptotischen Stoffen durch den MTT-Test-und Live/Dead Kit offenbart. Wenn einzeln angewandt, zeigte ActD und TNF-alpha keine zytotoxische Wirkung nach 24 h, die aber in Kombination auftrat. Die verwendeten Konzentrationen von OTA, H2O2 und die Dosis von UVC verursachte einen deutlichen Rückgang der Zellvitalität innerhalb von 36 h, der von Silibinin verhindert wurde. Zusammengenommen läßt sich feststellen, dass die durch OTA vermittelte Apoptose in kultivierten primären Rattenhepatozyten entgegen früherer Annahmen nicht durch TNF-alpha/ TNFR1, sondern durch Sauerstoffradikale und Lipidperoxidation verursacht wird. Silibinin ist eine sehr wirksame anti-apoptotisch wirkende Verbindung, die auch vor einer Zytotoxizität durch OTA und die anderen untersuchten Stoffe schützt.